МИОГЛОБИН

Миоглобин – белок, содержащийся в сердце и скелетных мышцах.

Он задерживает кислород в мышечных клетках, позволяя им вырабатывать энергию, необходимую для сокращения мышц. При повреждении сердца или скелетных мышц миоглобин выделяется в кровь, где циркулирует в течение нескольких часов. Затем он отфильтровывается из крови почками и выводится из организма с мочой. Большая концентрация миоглобина токсична для почек, и при серьезных травмах выброс миоглобина в кровь может привести к почечной недостаточности.

Миоглобин может быть использован как вспомогательный тест при диагностике инфаркта миокарда, однако он не является специфичным для этого заболевания, поскольку он выделяется в кровь при повреждении любых мышц. Одна из распространенных причин резкого повышения миоглобина в крови – рабдомиолиз, стремительный распад мышечной ткани. Он может быть вызван тяжелыми травмами (например, при автокатастрофе), поражении электрическим током, ожогами, тромбозом, интоксикации, некоторыми инфекциями (ВИЧ, грипп, стрептококк), неконтролируемым диабетом, гипо- и гипертиреозом, мышечными дистрофиями на поздних стадиях.

В каких случаях обычно назначают исследование?

• При травмах, ранениях, ожогах, других серьезных повреждениях мышц;
• При диагностике мышечной дистрофии;
• При подозрении на инфаркт миокарда вместе с анализом на тропонин и креатинкиназу-МВ.

Что именно определяется в процессе анализа?

Происходит измерение концентрации миоглобина в образце сыворотки крови пациента методом иммунотурбидиметрии.

Что означают результаты теста?

Содержание миоглобина в крови здорового человека ничтожно. Повышение уровня этого вещества указывает на повреждение мышечной ткани и может быть вызвано инфарктом миокарда, травмой, ранением, судорогами, хирургическими вмешательствами. Миоглобин повышается при рабдомиолизе, мышечных дистрофиях и миозитах (воспаление скелетных мышц).

Для оценки функции почек при повышении миоглобина в крови в некоторых случаях измеряют также концентрацию миоглобина в моче. Чем выше его уровень в моче, тем серьезнее риск развития острой почечной недостаточности и отказа почек. Помимо травм и других вышеописанных причин, миоглобин в моче может повышаться после чрезмерной физической активности у нетренированных спортсменов, при вирусных инфекциях, воздействии токсинов или лекарственных препаратов.

Сроки выполнения теста

Обычно результат анализа можно получить на следующий день после взятия крови.

Как подготовиться к анализу?

Следует придерживаться общих правил подготовки к взятию крови из вены.

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Здесь мы предоставляем подробный протокол использовать CZE-MS/MS для высокого разрешения характеристики proteoforms в образцах простых белков и для крупномасштабных идентификации proteoforms в образцах сложных протеома. Схема системы CZE-ЭСИ-MS/MS это показано на рисунке 1. Существует четыре важнейшие шаги в протоколе. Во-первых подготовка высококачественных LPA покрытия на внутренней стенке капилляра разделения является чрезвычайно важным. LPA-покрытием разделения капиллярного можно уменьшить EOF в капилляр, расширить окно разделения CZE и уменьшить белка адсорбции на своей внутренней стенки

19. Реакция полимеризации для изготовления LPA покрытие осуществляется через Заполнение капилляра с смесью акриламида (мономер) и Аммония пероксодисульфат (Инициатор полимеризации), следуют Отопление капилляров на водяной бане, чтобы вызвать ²²реакции. Время в водяной бане имеет решающее значение. Слишком короткое время реакции приведет к неполной реакции и плохое покрытие. Мы обычно позволяют реакция группы до 50 минут, позволяя реакции перейти на более длительный период для лучшего покрытия. С длительного реакции капилляр может быть заблокирован и ВЭЖХ насос может потребоваться использовать для вытолкнуть полимер внутри капилляра с водой. Один из капилляров, МПУ покрытием непрерывно может использоваться для около одной недели, основываясь на данных литературы и наш опыт

22.

Вторым важным шагом является муфта CZE MS с электро кинетически перекачиваемой оболочка потока CE-MS интерфейс^25,26. Расстояние между окончанием разделения капиллярного в эмиттере ESI и отверстия излучателя значительно влияет на чувствительность CZE-MS, и короткие расстояния производит выше чувствительность²⁵. В конце разделения капиллярного необходимо быть выгравированы с HF, чтобы уменьшить ее наружный диаметр от 360 мкм до менее чем 100 мкм, позволяя конец капилляра для толкания недалеко от отверстия излучателя. Расстояние между отверстия излучателя и масс-спектрометр вход был оптимизирован для достижения лучших чувствительность и хорошая устойчивость²⁶. Мы обычно держатся на расстоянии около 2 мм.

Третьим важнейшим шагом является CZE-МС и МС/МС анализ с динамические основанные на рН Джанкшен онлайн Образец укладки¹⁹. PH буфер образца и BGE должны быть значительно отличается, с тем чтобы обеспечить эффективное Образец укладки. Концентрация белка в образце должна быть соответствующей. Если слишком высока концентрация белков, белки можно ускорили в капилляр во время укладки образца. Концентрация белка образцов для

рисунки 2 и 3 можно рассматривать как типичные примеры. Последний важный шаг-это поиск в базе данных с TopPIC для proteoform идентификаторы³⁰. Несколько шагов необходимы для преобразования файлов, прежде чем можно выполнить поиск по базе данных с TopPIC. Надлежащего ФДР фильтр необходим для обеспечения качества выявленных proteoforms. Мы обычно используют 1% спектра уровня FDR для фильтрации результатов поиска базы данных. Мы отмечаем, что инициатива сверху вниз протеомики является очень хороший ресурс для методов протеомики сверху вниз и данных анализа программного обеспечения^32,33.

Мы должны отметить, что некоторые части протокола может потребоваться изменение слегка и устранения некоторых неполадок может потребоваться. Время полимеризации в водяной бане для подготовки LPA покрытия могут отличаться в разных лабораториях. Время для ВЧ травления разделения капиллярного может потребоваться быть слегка изменен из-за разной температуры в различных лабораториях. При создании интерфейса CE-MS, убедитесь, что электроспрей стабильной до резьбы разделения капиллярного в эмиттере электроспрей. Если не электроспрей или нестабильной электроспрей наблюдается, проверьте интерфейс, чтобы убедиться, что есть нет больших пузырей в эмиттере, в

Tили в трубку, которая используется для соединения оболочкой флакон буфера и Т. Кроме того, расстояние между отверстия излучателя и входа в масс-спектрометр может повлиять на стабильность электроспрей и обычно около 2 мм. Электроспрей напряжения может также повлиять на стабильность спрей. Для 20 — 40 мкм излучателей обычно достаточно 2-2,2 кв. Как описано в предыдущем пункте, концентрацию белка в образце должна быть соответствующей. Если слишком высока концентрация белков, белки можно ускорили в капилляр во время укладки образца. Обратите внимание на текущий профиль на компьютере автоматический пробоотборник CE. Если ток равен нулю в самом начале выполнения CZE, это означает, что вилки воздуха вдувается в капилляр во время инъекции шаг выборки. Убедитесь, что достаточно большой объем выборки во флаконе. Если текущей является нормальным в начале и вдруг становится ноль во время выполнения, это обычно означает, что концентрация белка является слишком высокой.

CZE-MS/MS, основанных на этом протоколе позволяет с высоким разрешением характеристику примеры простых белков и крупномасштабных сверху вниз протеомики сложных протеомов. В качестве примера CZE-MS подошли к высоким разрешением характеристика стандартных белка смеси, содержащей шесть белков¹⁹. Как показано на рисунке 2, CZE-MS четко отделены шестью белки с разделение высокой эффективности, выявили три формы β-казеина и обнаружено много примесей. В качестве другого примера single shot CZE-MS/MS можно воспроизвести принесли свыше 500 proteoform идентификаторов и 190 белка от протеома

E. coli , используя только 1 мкг E. coli белков с ФДР спектра уровень 1%¹⁹. CZE-MS/MS улучшить количество proteoform идентификаторы из сложных протеом, по крайней мере три раза, по сравнению с предыдущими исследованиями single shot CZE-MS/MS. Как показано на рисунке 3A, CZE-MS/MS одновременно достигли объем выборки загрузки 500-nL и 90 мин разделения окна для анализа E. coli протеома¹⁹. TopPIC программное обеспечение может предоставить всеобъемлющую информацию о выявленных proteoforms (рис. 3B). CZE-МС/МС система обеспечивает протеомики сообщества с полезным инструментом для крупномасштабных и высоким разрешением протеомики сверху вниз.

CZE-МС/МС все еще имеет некоторые ограничения для протеомики глубоко сверху вниз. Хотя мы продемонстрировали, что CZE-MS/MS может достигнуть над 500proteoform идентификаторы из

E. coli протеома в один проход, количество proteoform идентификаторы из single shot CZE-MS/MS является только примерно 50%, от^{, состояние искусства RPLC-MS/MS3435}. В этом протоколе только HCD используется для фрагментации белка, приводит к ограниченным фрагментации покрытий выявленных proteoforms. Внесены некоторые улучшения может быть протокол CZE-MS/MS повысить количество и качество proteoform идентификаторы из single shot CZE-МС/МС. Во-первых увеличение длины капиллярных разделения должна обеспечить более широкое разделение окна, приводит к более proteoform идентификаторы. Во-вторых быстрее с помощью масс-спектрометра с гораздо более высокой разрешающей способности, сканирование, скорость и несколько фрагментации методы (например, HCD,³⁶ электрона передачи диссоциации [ETD],

37 и ультрафиолетового фотодиссоциации [UVPD]³⁸ ) будет, безусловно, улучшить количество proteoform идентификаторы и фрагментации покрытия определенных proteoforms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Биохимические исследования

Биохимические исследования – обширный раздел лабораторных исследований, включающий определение содержания различных органических и неорганических веществ, образующихся в результате биохимических  реакций, а также измерение активности ферментов в сыворотке, плазме, крови, моче, ликворе и других биологических жидкостях.

Биохимические анализы отражают  функциональное состояние различных органов и систем, дают представление о состоянии обмена веществ.

Биохимические маркеры в зависимости от того, какой вид обмена  они характеризуют, делят на следующие группы:

• Маркеры белкового обмена — общий белок и белковые фракции: альбумин, ?-глобулины классов IgA, IgM, IgG
• Маркеры углеводного обмена – глюкоза сыворотки крови и мочи, глюкоза крови методом непрерывного мониторирования, гликозилированный гемоглобин
• Маркеры липидного обмена —  холестерин, триглицериды, липидограмма (ЛПВП, ЛПОНП, ЛПНП), коэффициент атерогенности

Также выделяют группы биохимических тестов, необходимых  для диагностики нарушений функционирования того или иного органа:

• Показатели функции печени и желчевыводящих путей  — билирубин (общий, прямой, непрямой), аминотрансферазы (АлТ, АсТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), гамма-глютамилтрансфераза (ГГТ), щелочная фосфатаза
• Показатели функции почек – электролиты (натрий, калий, хлор), мочевина, креатинин, мочевая кислота в сыворотке крови и моче, клиренс креатинина (проба Реберга), белок, альбумин мочи
• Показатели функции поджелудочной железы — ? — амилаза сыворотки крови и мочи, липаза сыворотки крови
• Маркеры кардиопатологии — креатинкиназа общая (КФК), изофермент креатинкиназы (КФК-МВ), миоглобин, тропонин I, ЛДГ, АСТ
• Диагностические маркеры анемий – железо сыворотки, общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС), трансферрин, коэффициент насыщения трансферрина железом, ферритин
• Маркеры острой фазы воспаления —  прокальцитонин, С — реактивный белок (СРБ)
• Маркеры остеопороза – щелочная фосфатаза, фосфор, кальций
• Показатели водно-электролитного обмена — калий, кальций, натрий, магний, фосфор, хлориды в сыворотке крови и моче
• Исследования кислотно-основного состояния, газового состава и метаболитов крови  — водородный показатель (рН), осмолярность, лактат, электролиты, бикарбонаты крови, общий диоксид углерода

Биохимические исследования выполняются на автоматическом биохимическом анализаторе.

Отделение лабораторной диагностики НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова оснащено самым современным оборудованием для исследований.

Оптимальное время для сдачи крови на исследование  утреннее, не ранее 8 часов после последнего приема пищи. За 3 дня до сдачи анализов желательно исключить употребление жирной пищи и алкоголя, а накануне исключить чрезмерные физические нагрузки. В день сдачи анализа не рекомендуется курение.

Готовность результатов исследований в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова в течение суток.

Большая Энциклопедия Нефти и Газа, статья, страница 3

Хромопротеид

Cтраница 3

Другим важным представителем хромопротеидов может служить миоглобин. Этот протеид придает красную окраску мышцам и обеспечивает сохранение запаса кислорода в мышечных клетках путем превращения в устойчивый оксимиоглобин.  [31]

Наиболее важным представителем хромопротеидов является красящее вещество крови — гемоглобин. Химическое строение гемоглобина и его важнейшие свойства были уже разобраны ( стр. Рассмотрим вопрос о путях распада и синтеза этого пигмента в организме человека.  [32]

Другим важным представителем хромопротеидов может служить миоглобин. Этот протеид придает красную окраску мышцам и обеспечивает сохранение запаса кислорода в мышечных клетках путем превращения в устойчивый оксимиоглобин.  [33]

Цитохромы группы А — хромопротеиды, у которых простетической группой является гемин А, после удаления железа превращающийся в порфирин А. Представители этой группы цитохромы а и аа, входящие в цитохромоксидазный комплекс дыхательной цепи. Непосредственно с кислородом взаимодействует только цитохром аа.  [34]

Цитохромы группы С — хромопротеиды, у которых простатической группой является замещенный мезоген IX, соединенный с апоферментом тиоэфирными связями. Цитохромы группы С функционируют в дыхательной цепи, осуществляя перенос электронов. Цитохром с получают высокоочищенным, изучены его физико-химические, молекулярные и каталитические свойства. Свойства цнтохромов с из различных природных источников являются весьма сходными: мол.  [35]

Краситель крови гемоглобин является хромопротеидом, состоящим из белка — глобина — и собственно красителя-гема G34h4204N4Fe ( см. стр. Гем представляет собой соединение протопорфирина С34Н3404 с комплексно связанным двухвалентным железом.  [36]

В гемоглобине, относящемся к хромопротеидам, в молекуле тема центральный атом двухвалентного железа связан с четырьмя расположенными с ним в одной плоскости атомами азота порфириновой части молекулы; над этой плоскостью пятую вершину октаэдра образует молекула воды, а под плоскостью шестую вершину — азот гистидинного остатка белка — глобина.  [38]

По химической структуре гемоглобин представляет собой хромопротеид. Он состоит из белка глобина и простетической группы тема. В молекуле гемоглобина содержится одна молекула глобина и 4 молекулы тема. Железо входит в состав всех дыхательных ферментов тканей. Такая важная роль железа в дыхании определяется строением его атома — большим числом свободных электронов, способностью к комплексообразованию и к участию в реакциях окисления-восстановления.  [39]

Гемопротеиды — сложные белки, представители хромопротеидов, простетической группой у которых является железопорфирин.  [40]

В результате распада гемоглобина in vivo образуются хромопротеиды, имеющие зеленую окраску. Билирубин содержит четыре пирроловых кольца, линейно соединенных друг с другом.  [41]

На колонках с гидроксилапатитом особенно хорошо разделяются высокомолекулярные хромопротеиды водорослей.  [42]

Некоторые сложные белки, объединяемые под общим названием хромопротеиды, окрашены и включают в себя довольно разнообразные вещества небелковой природы, несущие окраску. Среди таких белков следует отметить прежде всего гемоглобин и миоглобин, у которых небелковые ( простетиче-ские) группы являются производными железопорфиринов.  [44]

На основании изложенного следует, что простетическая группа хромопротеидов пищи не может быть использована как таковая для синтеза соответствующих сложных белков в животном организме.  [45]

Страницы:      1    2    3    4

haemoglobin and myoglobin — Russian translation – Linguee

It could be related to intense autofluorescence due to a […] large amount of endogenous porphyrinic […] structures being the components of hemoglobin, myoglobin, catalase, peroxidase, and numerous cytochromes. stm.rnn.ru	Это может быть связано с выраженной автофлюоресценцией, обусловленной присутствием большого […] количества эндогенных […] порфириновых структур, входящих в состав гемоглобина, миоглобина, ферментов каталазы, пероксидазы и многочисленной […] группы цитохромов. stm.rnn.ru
As with sulfur mustard, techniques based on protein adducts might become available, more especially the quantification […] of the metabolite […] 2-chlorovinylarsonous acid bound to haemoglobin and detectable in blood 10 days […] after subcutaneous administration to experimental animals. helid.digicollection.org	Так же как и в случае сернистого иприта, могут быть использованы методы, основанные на аддуктах белка – […] определение количества […] метаболита 2-хлорвиниларсоновой кислоты, связанного с гемоглобином и обнаруживаемого […] в крови через 10 дней […] после подкожного введения подопытным животным. helid.digicollection.org
It is interesting that the recently discovered […] transport system «necessary […] for complete virulence,» providing for the passage of iron and manganese into Y. pestis cells [145], is still unique; the HmuTUV system, necessary for the use of hemin, hemin-albumin, myoglobin, but not hemoglobin, hemoglobin-haptoglobin, or heme-hemopexin […] as iron sources, does […] not play a vital role in the development of infection in mice [259]. obolensk.org	Интересно, что «необходима для полной […] вирулентности» и еще одна недавно […] выявленная транспортная система, обеспечивающая поступление в клетки Y. pestis железа и марганца [145]. С другой стороны, HmuTUV система, необходимая для использования в качестве источников железа гемина, гемин-альбумина и миоглобина, но не гемоглобина, гемоглобин-гаптоглобина […] […] или гемгемопексина, не играет существенной роли в развитии инфекции у мышей [259]. obolensk.org
In the diagnosis of exposure to sulfur mustard in […] humans, alkylation products of sulfur […] mustard with haemoglobin, albumin and DNA in blood, […] as well as metabolites of sulfur […] mustard in urine, have proved to be useful targets. helid.digicollection.org	При диагностике воздействия сернистого иприта на людей полезными объектами […] исследования оказались продукты алкилирования […] сернистого иприта с гемоглобином, альбумином и ДНК в […] крови, а также метаболиты сернистого иприта в моче. helid.digicollection.org
(b) Artificially enhancing the uptake, transport or delivery of oxygen, including but not limited to perfluorochemicals, efaproxiral (RSR13) and modified haemoglobin products (e.g. haemoglobin—based blood substitutes, micro-encapsulated haemoglobin products). unesdoc.unesco.org	(b) Искусственное повышение способности крови […] поглощать, транспортировать и доставлять кислород, например, с помощью перфторирования, или использования эфапроксирала (RSR13) и модифицированных продуктов на основе гемоглобина (например заменители крови на основе гемоглобина, гемоглобиновые продукты в микрокапсулах). unesdoc.unesco.org
A second major advance came a few months […] later, when Max Perutz discovered a technique to determine the structures […] of large molecules like myoglobin and hemoglobin. project-syndicate.org	Следующее большое достижение было сделано несколько […] месяцев спустя, когда Макс Перутц нашел способ определения структуры […] крупных молекул, таких как миоглобин и гемоглобин. project-syndicate.org
With haemoglobin, the adducts with the amino function in terminal valine of the α— and ßchains have proved […] to be most convenient for diagnosis. helid.digicollection.org	В случае гемоглобина самыми подходящими для диагностики оказались аддукты с аминофункцией в концевом […] валине α- и ß-цепочки. helid.digicollection.org
Of course, real monitoring, and research about the effects of the product on child development, including haemoglobin levels in blood, will be carried out later, […] in half a year’s time at a minimum. un.org.kg	Конечно, настоящий мониторинг, исследования воздействия продукта на развитие детей, в том числе уровень гемоглобина в крови, будет проводиться позже, минимум через […] полгода. un.org.kg
At the same time, against a background of prolonged antiviral therapy (48 or 72 weeks in genotype 1 hepatitis C virus), a deterioration of patients was often observed, as was the development of side effects of therapy: predominantly […] neuropsychological disorders […] (irritability, insomnia, mood swings, general weakness and malaise), fever, decreased haemoglobin, changes in thyroid function, alopecia, dry […] skin, etc. In some cases, antiviral […] therapy had to be discontinued because of the side effects. polunina.emcmos.ru	При этом на фоне длительной противовирусной терапии (48 или 72 недели при генотипе 1 вирус гепатита С) очень часто наблюдалось ухудшение состояния пациентов и развитие побочных эффектов терапии: преимущественно […] нейропсихологические расстройства […] (раздражительность, бессонница, снижение настроения, общая слабость и недомогание), повышение температуры, снижение уровня гемоглобина, изменения функции […] щитовидной железы, аллопеция, […] сухость кожных покровов и др. emcmos.ru
Inhalation is reported to cause anaemia in some […] individuals, and the haematopoietic system is also affected in animals exposed to […] chloropicrin, with reduced erythrocyte, haemoglobin and haematocrit (erythrocyte volume […] fraction) counts (12). helid.digicollection.org	Согласно некоторым сообщениям, ингаляция у некоторых людей вызывает анемию; у животных, […] подвергшихся воздействию хлорпикрина, поражается […] также кроветворная система с уменьшением количества эритроцитов, гемоглобина […] и гематокритов (относительное содержание эритроцитов в крови) (12). helid.digicollection.org
In their statements, most Member States stressed the need for the revitalization of the United Nations to enable it to effectively address critical issues such as sustainable development, poverty reduction, human rights, […] terrorism as well as United Nations reform, […] HIV/AIDS, peace and security, weapons of mass destruction and nuclear proliferation. unesdoc.unesco.org	В своих заявлениях представители большинства государств-членов подчеркнули необходимость придания нового импульса деятельности Организации Объединенных Наций, с тем чтобы она могла эффективно решать важнейшие проблемы, такие как устойчивое развитие, борьба с нищетой, права человека, […] терроризм, реформа […] Организации Объединенных Наций, борьба с ВИЧ/СПИДом, мир и безопасность, оружие массового […] уничтожения и распространение […] ядерного оружия. unesdoc.unesco.org
He encourages the Government of Kenya, with the support of the international community and civil society, to take the necessary measures to address the above concerns, to ratify the African Union Convention for the Protection and Assistance of Internally Displaced Persons in Africa (Kampala Convention), and to adopt the draft policy and draft bill on IDPs, which will provide a solid framework with which the country can prevent, manage and find durable solutions to internal displacement situations. daccess-ods.un.org	Он призывает правительство Кении при поддержке международного сообщества и гражданского общества принять необходимые меры для решения вышеупомянутых проблем, ратификации принятой Африканским союзом Конвенции о защите внутренне перемещенных лиц и оказании им помощи (Кампальская конвенция) и принятия проекта политики и законопроекта по вопросу ВПЛ, которые послужат солидной основой, с помощью которой страна сможет предотвращать ситуации внутреннего перемещения лиц, управлять ими и находить долгосрочные решения. daccess-ods.un.org
With funds provided by the Spanish Government, UNESCO continued the project on Digital Library of Latin America and the Caribbean, a regional virtual library based on the national libraries of Latin America and the Caribbean, offering libraries free know-how and a software application tool (in Spanish, English and Portuguese) for creating digital and virtual libraries. unesdoc.unesco.org	Благодаря финансовой поддержке со стороны правительства Испании ЮНЕСКО продолжала работу в рамках проекта по созданию цифровой библиотеки Латинской Америки и Карибского бассейна, которая представляет собой региональную виртуальную библиотеку на базе на циональных библиотек Латинской Америки и Карибского бассейна и которая распространяет среди библиотек бесплатное ноу-хау и программное обеспечение (на испанском, английском и португальском языках), помогающие создавать цифровые и виртуальные библиотеки. unesdoc.unesco.org
The establishment of reporting […] mechanisms includes: (a) providing appropriate information to facilitate the making of complaints; (b) participation in […] investigations and court proceedings; (c) developing protocols which are appropriate for different circumstances and made widely known to children and the general public; (d) establishing related support services for children and families; and (e) training and providing ongoing support for personnel to receive and advance the information […] received through reporting systems. daccess-ods.un.org	Создание механизмов подачи информации включает: а) представление соответствующей информации для […] содействия подаче жалоб; b) участие в расследованиях и судебных процедурах; с) разработку протоколов, которые можно использовать в различных обстоятельствах, и широкое информирование о них детей и населения в целом; d) создание соответствующих служб поддержки для детей и семей; и е) подготовку и обеспечение постоянной поддержки персонала […] в деле получения и передачи данных, поступивших через системы […] подачи информации. daccess-ods.un.org
Switzerland stated that the State understands that security policy must be paired with full respect for human rights and international law and recognized that important measures have been taken, but it encouraged the authorities (a) to strengthen the judiciary and guarantee its independence; the (b) National Commission for Reparation and Reconciliation and the Working Group on Historical Memory to intensify their work in order to fully clarify past crimes and give voice to the victims. daccess-ods.un.org	Отметив, что Колумбия хорошо понимает, что политика обеспечения безопасности должна увязываться с полным уважением прав человека и норм международного права, и признав принятие ряда важных мер в этой области, делегация Швейцарии призвала: а) власти страны укрепить судебную систему и гарантировать ее независимость; b) Национальную комиссию по возмещению ущерба и примирению и Рабочую группу по вопросам исторической памяти активизировать работу с тем, чтобы пролить свет на преступления прошлого и дать слово их жертвам. daccess-ods.un.org
Competition law promotes […] competitive behaviours (rivalry, independent behaviour, incentives to develop better offers of goods ands services) leading to a range of choices/options in services and goods available to the consumer, whereas consumer protection law reinforces consumers’ access and freedom to select among the available choices/options according to their preferences and interests. daccess-ods.un.org	Антимонопольное законодательство направлено на развитие конкуренции […] (соперничества, независимого поведения, стимулов […] для выхода с более выгодными предложениями товаров и услуг), благодаря которой у потребителей появляется ряд возможностей выбора/вариантов получения товаров и услуг, в то время как законодательство о защите прав потребителей ограждает права и возможности выбора потребителями из числа имеющихся возможностей/вариантов в соответствии с их предпочтениями и интересами. daccess-ods.un.org
Participants were members of the Dai Kundi […] Provincial Sectoral Working Groups on Social Protection, Education and Health, responsible for their five-year development planning process, linked to the ANDS and the Dai Kundi PDP. daccess-ods.un.org	В этих мероприятиях участвовали члены секторальных рабочих групп провинции […] Дайкунди по социальной защите, образованию и здравоохранению, в задачи которых входит разработка пятилетних планов в области развития, связанных с осуществлением НСРА и ППР Дайкунди. daccess-ods.un.org
General comment No. 11 underscores the importance of the child to be […] registered, to bilingual education, to health, to the enjoyment of […] culture, religion ands language, and to participation. daccess-ods.un.org	В замечании общего порядка № 11 подчеркивается важность права ребенка на […] регистрацию, на двуязычное образование, на здоровье, […] на свою культуру, религию и язык, а также на участие […] в жизни общества. daccess-ods.un.org
The right to food is not explicitly contained in relevant national strategies such as the ANDS, the National Health and Nutrition Strategy, or the National Agriculture Development Framework; although certain elements such as adequacy and availability have been addressed. daccess-ods.un.org	Право на питание не отражено в полной мере в соответствующих национальных стратегиях, например НСРА, Национальной стратегии в области здравоохранения и питания или Национальных рамках развития сельского хозяйства, при этом некоторые элементы в них все-таки учтены, например достаточность и доступность. daccess-ods.un.org
The Joint Coordination and Monitoring Board (JCMB), a body responsible for implementation of the Afghanistan National Development Strategy (ANDS) in which the Action Plan is a benchmark, failed to address the issue and did not take decisive steps to envisage a comprehensive strategy to fight against impunity for past and current human rights violations. daccess-ods.un.org	Объединенный совет по координации и контролю (ОСКК) в качестве органа, отвечающего за осуществление Национальной стратегии развития Афганистана (НСРА), в рамках которой План действий является одним из целевых показателей, не сумел решить эту проблему и не предпринял решительных шагов по созданию комплексной стратегии борьбы с безнаказанностью за прошлые и нынешние нарушения прав человека. daccess-ods.un.org
ANDS generally frames human rights in civil and political terms only and fails to identify the Government’s obligations under the various treaties it has ratified. daccess-ods.un.org	В целом в этой стратегии права человека затрагиваются лишь применительно к гражданской и политической сфере и не учитываются обязательства правительства по различным ратифицированным им международным договорам. daccess-ods.un.org
Given that all United Nations agencies will be involved in supporting the implementation of the ANDS, they should be encouraged to adopt the human rights-based approach (HRBA) to development as an efficient tool to address the needs of the people through the prism of rights and to support the efforts of the Government in meeting its obligations. daccess-ods.un.org	Учитывая, что все учреждения системы Организации Объединенных Наций будут участвовать в поддержке реализации НСРА, их следует призвать к тому, чтобы в области развития они принимали основанный на концепции прав человека подход (КПЧП) и использовали его в качестве действенного механизма удовлетворения потребностей населения через призму соблюдения прав человека и поддерживали усилия правительства в выполнении им своих обязательств. daccess-ods.un.org
The Afghanistan National Development Strategy (ANDS), while highlighting human rights, does so in a limited way by mainly focusing on civil and political rights. daccess-ods.un.org	Хотя в национальной стратегии развития Афганистана (НСРА) правозащитной проблематике отводится важная роль, основной упор делается лишь на гражданские и политические права. daccess-ods.un.org
The Secretary-General reported that the ANDS recognizes that poverty and lack of access to food, medical care and education remained major obstacles to equitable and sustainable socioeconomic development. daccess-ods.un.org	По сообщениям Генерального секретаря, в НСРА признается, что нищета и отсутствие доступа к продовольствию, здравоохранению и образованию по-прежнему являются главными препятствиями на пути справедливого и устойчивого социальноэкономического развития. daccess-ods.un.org
The Afghan National Development Strategy (ANDS) was approved by President of Afghanistan on 21 April 2008 for the implementation of a series of priorities, programs, and projects envisaged for the years 2008-2013. daccess-ods.un.org	Национальная стратегия развития Афганистана (НСРА) была одобрена Президентом Афганистана 21 апреля 2008 года с целью реализации ряда приоритетных задач, программ и проектов, запланированных на 2008-2013 годы. daccess-ods.un.org
As both the ANDS and the Provincial Development Plans (PDPs), designed to support ANDS implementation, have been criticized for not focusing on human rights outcomes, OHCHR/UNAMA undertook various […] efforts to mainstream human […] rights in development planning. daccess-ods.un.org	Поскольку НСРА и Провинциальные планы развития (ППР), нацеленные на оказание поддержки реализации НСРА, подвергались критике за недостаточную ориентированность на достижение результатов в сфере […] прав человека, УВКПЧ/МООНСА […] были предприняты разнообразные усилия по учету правозащитной проблематики в планах развития. daccess-ods.un.org
The reduction of women’s vulnerability to violence in […] both domestic and public life, and improved access to gender sensitive justice systems are key objectives of the ANDS. daccess-ods.un.org	Важнейшими целями в этой стратегии […] признаны […] задачи снижения уровня уязвимости женщин как в частной, так и общественной жизни и более открытый доступ к гендерно-специфическим […] […] системам отправления правосудия. daccess-ods.un.org
(e) Efforts should continue to be made to ensure that the human rights perspective is fully integrated into the implementation of the […] Afghanistan National […] Development Strategy (ANDS), which serves as the country’s poverty reduction strategy, and other development policies and programmes aimed […] at alleviating poverty. daccess-ods.un.org	е) следует продолжить усилия по полномасштабному включению правозащитного аспекта в […] процесс выполнения […] Cтратегии Афганистана по сокращению масштабов нищеты (НСРА) и других проектов и программ в области развития, нацеленных на сокращение […] масштабов нищеты. daccess-ods.un.org

Возможна ли жизнь без гемоглобина?

В декабре 1927 года норвежский зоолог Дитлев Рустад в 1750 километрах от побережья Антарктиды обнаружил очень странную рыбу с прозрачным телом и молочно-белыми жабрами. Когда Рустад вскрыл рыбу, он обнаружил, что ее кровь была бесцветной, как стекло. Так в его дневнике появилась запись «бесцветная кровь»…

Зачем нужен гемоглобин?

Практически всем видам позвоночных животных для транспорта кислорода к тканям необходима специальная система доставки, поскольку молекулярный кислород плохо растворим в воде: в 1 л плазмы крови растворяется всего лишь 3,2 мл О₂. Содержащийся в эритроцитах позвоночных белок гемоглобин (Hb, рис. 1) способен связать в 70 раз больше — 220 мл О₂/л. Содержание Hb в крови человека варьирует в пределах 120–180 г/л, что вдвое выше, чем концентрация белков плазмы (50–80 г/л). Поэтому гемоглобин вносит наибольший вклад в поддержание рН-буферной емкости крови. По своей структуре гемоглобин взрослого человека (HbA) является тетрамером, состоящим из двух α- и двух β-субьединиц с молекулярными массами около 16 кДа. α- и β-цепи отличаются аминокислотной последовательностью, но имеют сходную конформацию.

Рисунок 1. Молекула гемоглобина. Гемоглобин является одним из наиболее хорошо изученных белков. Он был открыт немецким физиологом Отто Функе в 1851 году, а структуру этого белка описал австрийский молекулярный биолог Макс Перутц в 1959 году, за что тремя годами позднее получил Нобелевскую премию по химии [1].

Рисунок 2. Насыщение гемоглобина и миоглобина кислородом

Каждая субъединица гемоглобина несет группу гема с ионом двухвалентного железа в центре. При связывании O₂ с атомом железа в геме (оксигенация Hb) и отщеплении O₂ (дезоксигенация) степень окисления атома железа не меняется. Окисление Fe²⁺ до Fe³⁺ в геме носит случайный характер. Окисленная форма гемоглобина — метгемоглобин — не способна переносить O₂. Доля метгемоглобина поддерживается ферментами на низком уровне и составляет 1–2% [2]. Центры связывания O₂ на каждой из четырёх субъединиц действуют кооперативно: когда молекула O₂ связывается с одним из них, у других возрастает сродство к кислороду (данное явление называют положительной кооперативностью) [3]. Вследствие этого кривая насыщения гемоглобина кислородом имеет ярко выраженный сигмоидальный характер (рис. 2, кривая 2).

Другой мышечный белок — миоглобин, являющийся эволюционным предшественником гемоглобина, — является мономером и содержит единственный центр связывания O₂, из-за чего его кривая насыщения кислородом несигмоидальна (рис. 2, кривая 1). Сродство к кислороду у миоглобина примерно в 13 раз выше, чем у гемоглобина (50%-насыщение миоглобина O₂ достигается уже при парциальном давлении кислорода в 1–2 мм рт. ст., в то время как для гемоглобина эта цифра равна 26 мм рт. ст.) [4]. Из-за этого гемоглобин способен эффективно отдавать кислород в тканях и является более эффективным переносчиком, чем миоглобин. Но из этого не следует, что миоглобин малоэффективный и плохо устроенный белок, поскольку он выполняет принципиально иную биологическую функцию — запасание кислорода и обеспечение им митохондрий. Данные адаптивные различия между миоглобином и гемоглобином появились в результате миллионов лет эволюции…

Прозрачные рыбы

В 1927 году экспедицией норвежских китобоев близ острова Буве во время очередной промысловой охоты была поднята на сушу невиданная рыба, практически бесцветная и, самое интересное, с прозрачной («стеклянной») кровью. Это был первый обнаруженный вид позвоночных, не содержащих белка гемоглобина. За счет поразительного сходства головы рыбы с головой крокодила, рыбу назвали крокодиловая белокровка (Chaenocephalus aceratus). Белокровки (Channichthyidae; рис. 3) или ледяные рыбы обитают в холодных водах возле Антарктиды и южного побережья Южной Америки. Температура воды в этих краях опускается аж до −1,9 °C (температура замерзания морской воды ниже, чем пресной), причем является довольно постоянной.

Рисунок 3. Некоторые представители белокровок. а — Chaenodraco wilsoni. б — Chaenocephalus aceratus. в — Champsocephalus gunnari. г — Cryodraco atkinsoni. Белокровки (Channichthyidae) — семейство из отряда Окунеобразные (Perciformes), в котором описано 16 видов. Данные рыбы питаются крилем, рачками и другими рыбами. Недавние исследования показали, что рацион этих рыб различается в зависимости от возраста. В целом, в рационе преобладает антарктический криль (Euphausia superba) и равноногие рачки (Themisto gaudichaudii). В рационе молодых особей преобладает Т. gaudichaudii и эвфаузииды (Thyanoessa sp.), а доля антарктического криля меньше. Ледяные рыбы достигают общей длины 25–75 см. Они являются пелагиальными представителями антарктических вод, обитают на глубине от 200 до 700 метров. Некоторые подвиды C. aceratus обнаруживаются в районе 1–2 тыс. метров. Белокровки — доминирующий вид в Антарктиде, полностью лишенный плавательного пузыря, в связи с чем многие виды этих рыб являются донными.

Очень немногие рыбы могут выжить в суровых условиях Антарктики. Ледяная рыба выживает за счет специального антифриза, присутствующего в крови и предотвращающего образование кристаллов льда в организме. Этот антифриз (AFGP, antifreeze glycoprotein) представляет собой гликопротеин, предположительно произошедший от панкреатической трипсиногеноподобной протеазы [9]. AFGP способен связываться с микроскопическими кристалликами льда и предотвращать их рост [10].

Ледяные рыбы имеют очень низкий уровень метаболизма и проводят большую часть времени практически неподвижно. Белокровки обитают в богатой кислородом воде и поглощают его непосредственно через кожу [11], потому что при пониженных температурах кровь, содержащая гемоглобин, становится очень вязкой, и выживание с такой кровью было бы весьма проблематично.

Отсутствие гемоглобина компенсируется модификацией сердечнососудистой системы. Все представители ледяных рыб имеют большее сердце, чем у других рыб такого же размера, а это увеличивает ударный объем, в несколько раз повышает общее количество циркулирующей крови и поднимает скорость кровотока. При низком артериальном давлении это достигается за счет снижения системного сопротивления потоку. Сочетание высокой пропускной способности сердечнососудистой системы, высокого содержания кислорода и относительно низких скоростей метаболизма ледяной рыбы позволяет обеспечить достаточное количество кислорода в тканях [12].

Гемоглобиновая потеря

Белокровки пережили потерю генов гемоглобина достаточно давно. Как показывает молекулярный анализ, почти у всех ледяных рыб одна мутация привела к потере гена, кодирующего β-цепь и часть α-цепи гемоглобина. Потеря способности к синтезу гемоглобина вызвала развитие компенсаторных изменений: увеличился объем сердца и общий объем крови (приблизительно в 3.5 раза по сравнению с костистыми рыбами аналогичного размера) [13–15]. Ученые, проанализировав ДНК представителей нототениевых рыб, пришли к выводу, что только у одного вида белокровок (Neopagetopsis iona) присутствуют гены гемоглобина, но они не являются функциональными [16].

Наряду с гемоглобином, у белокровок отсутствует и миоглобин, переносящий кислород в скелетных мышцах. При этом у десяти видов миоглобин сохранился только в сердечной мышце (в частности, в желудочке) [17], а у шести видов миоглобин был утрачен и там, причем механизм утраты гена у каждого вида индивидуален [18]. Общим механизмом подобной утраты является дупликация коротких (5–25-нуклеотидных) фрагментов, приводящая к сдвигу рамки считывания, преждевременной терминации транскрипции, появлению ложного сигнала полиаденилирования или нарушению связывания РНК-полимеразы с промоторной областью ДНК [19], [20].

Утрата гемоглобина первоначально должна была стать адаптацией к холоду: известно, что растворимость кислорода в холодной воде выше [21], а значит, потребность в гемоглобине, напротив, меньше. Отсутствие эритроцитов также снижает вязкость крови, что особенно критично в условиях экстремально низкой температуры. В процессе эволюции у белокровок произошли довольно радикальные изменения, компенсирующие утрату гемоглобина, включая вдвое большие энергозатраты по перекачке крови по сравнению с другими рыбами [22].

Ледяные рыбы произошли от малоподвижного донного предка. В холодных, хорошо перемешиваемых, богатых кислородом антарктических водах рыбы с низкой скоростью метаболизма могут выжить даже без гемоглобина. В середине третичного периода экологический кризис в Южном океане, вызванный похолоданием [23], привел к появлению обширных пустующих экологических ниш. Отсутствие конкуренции позволило мутантам, не имеющим гемоглобина, оставить после себя потомство, которое заселило пустые места обитания. У детенышей развились механизмы компенсации мутаций. В относительно изолированных фьордах образовались места обитания, которые колонизировали несколько особей, что привело к возникновению шести видов рыб, изолированных друг от друга и независимо потерявших гены глобинов [22].

Гистологически показано, что особенностью ледяных рыб является высокий объем митохондрий при сходном их количестве и высокое отношение липид/белок в митохондриальных мембранах в сравнении с близкородственными видами семейства нототениевых рыб (рис. 4). Интересно, что у белокровок, у которых отсутствует миоглобин в скелетной мускулатуре, но присутствует в сердечной, объем митохондрий в скелетных мышцах существенно выше, чем в миокарде. О молекулярных механизмах этого феномена известно довольно мало. Предположительно, это явление связанно с одним из ключевых белков-регуляторов биогенеза митохондрий PGC-1α  [23].

Рисунок 4. Поперечный разрез миоцитов желудочков сердца (C. aceratus). Большие митохондрии (Mt) по периферии окружены миофибриллами (My).

Регулятором биогенеза мембран митохондрий у белокровок является оксид азота-II (NO) (рис. 5). По сравнению с другими рыбами, у белокровок наблюдается повышенное содержание этого сигнального агента в крови. В ответ на потерю гемоглобина и миоглобина в мышцах ледяных рыб увеличивается биосинтез фосфолипидов, причем, независимо от синтеза митохондриальных белков и репликации митохондриальной ДНК, это приводит к увеличению размера митохондрий. Молекула NO стимулирует образование PGC-1α, который регулирует репликацию митохондриальной ДНК. Но ничего не известно о том, как биосинтез митохондриальных фосфолипидов интегрирован в этот процесс у ледяных рыб; возможно, это индуцируется высоким уровнем NO (темная стрелка на рисунке) [18].

Рисунок 5. Процесс биогенеза митохондрий у ледяных рыб. Образование митохондрий включает в себя синтез митохондриальных белков (синие точки), фосфолипидов и репликацию митохондриального генома (зеленые кружки). В ответ на стимулы, такие как понижение температуры (или повышение физической нагрузки у млекопитающих) эти три компонента митохондриального биогенеза согласованно активируется, что приводит к увеличению плотности митохондрий.

Заключение

Безусловно, гемоглобин — жизненно важный белок, на котором основано дыхание большинства организмов. Эволюция гемоглобина происходила миллионы лет, но в специфических условиях Антарктики (холодная вода, обогащенная кислородом) адаптивные преимущества могут достигаться за счет эволюционной утраты гемоглобина (дезадаптация). Ледяные рыбы являются одной из ярких иллюстраций того, как гены, которые считаются абсолютно необходимыми для жизни позвоночных, в определенных условиях могут редуцироваться, обеспечивая выживание вида. Причудливы пути эволюции.

1. Макс Перутц. «Наука и техника»;
2. Кольман Я., Рём К.-Г., Вирт Ю. Наглядная биохимия. М.: «Мир», 2000. — 469 с.;
3. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: «Мир», 1985. — 369 с.;
4. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. М.: «Мир», 1977. — 574 с.;
5. Tate R.C. Fishes. London: Printed by order of the trustees of the British Museum, 1914;
6. Tate R.C. Antarctic fishes of the Scottish National Antarctic expedition. Edinburg: Robert Grant & Son, Williams & Norgate, 1913;
7. Champsocephalus gunnari. Encyclopedia of life;
8. Википедия: Белокровные рыбы;
9. Chi-Hing C. Cheng, Liangbiao Chen. (1999). Evolution of an antifreeze glycoprotein. Nature. 401, 443-444;
10. J. A. Raymond, A. L. DeVries. (1977). Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74, 2589-2593;
11. C.-H Christina Cheng, H William Detrich. (2007). Molecular ecophysiology of Antarctic notothenioid fishes. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 362, 2215-2232;
12. Karl-Hermann Kock. (2005). Antarctic icefishes (Channichthyidae): a unique family of fishes. A review, Part I. Polar Biol. 28, 862-895;
13. Yuqiong Zhao, Manoja Ratnayake-Lecamwasam, Sandra K. Parker, Ennio Cocca, Laura Camardella, et. al.. (1998). The Major Adult α-Globin Gene of Antarctic Teleosts and Its Remnants in the Hemoglobinless Icefishes. J. Biol. Chem.. 273, 14745-14752;
14. Guido di Prisco, Ennio Cocca, Sandra K Parker, H.William Detrich. (2002). Tracking the evolutionary loss of hemoglobin expression by the white-blooded Antarctic icefishes. Gene. 295, 185-191;
15. Guido di Prisco, Joseph T. Eastman, Daniela Giordano, Elio Parisi, Cinzia Verde. (2007). Biogeography and adaptation of Notothenioid fish: Hemoglobin function and globin–gene evolution. Gene. 398, 143-155;
16. T. J. Near. (2006). A Genomic Fossil Reveals Key Steps in Hemoglobin Loss by the Antarctic Icefishes. Molecular Biology and Evolution. 23, 2008-2016;
17. B. D. Sidell, M. E. Vayda, D. J. Small, T. J. Moylan, R. L. Londraville, et. al.. (1997). Variable expression of myoglobin among the hemoglobinless Antarctic icefishes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 3420-3424;
18. K. M. O’Brien, I. A. Mueller. (2010). The Unique Mitochondrial Form and Function of Antarctic Channichthyid Icefishes. Integrative and Comparative Biology. 50, 993-1008;
19. D. J. Small. (2003). The myoglobin gene of the Antarctic icefish, Chaenocephalus aceratus, contains a duplicated TATAAAA sequence that interferes with transcription. Journal of Experimental Biology. 206, 131-139;
20. B. D. Sidell. (2006). When bad things happen to good fish: the loss of hemoglobin and myoglobin expression in Antarctic icefishes. Journal of Experimental Biology. 209, 1791-1802;
21. L. Bargelloni, S. Marcato, T. Patarnello. (1998). Antarctic fish hemoglobins: Evidence for adaptive evolution at subzero temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 8670-8675;
22. Daniela Giordano, Ignacio Boron, Stefania Abbruzzetti, Wendy Van Leuven, Francesco P. Nicoletti, et. al.. (2012). Biophysical Characterisation of Neuroglobin of the Icefish, a Natural Knockout for Hemoglobin and Myoglobin. Comparison with Human Neuroglobin. PLoS ONE. 7, e44508;
23. M. R. Urschel, K. M. O’Brien. (2008). High mitochondrial densities in the hearts of Antarctic icefishes are maintained by an increase in mitochondrial size rather than mitochondrial biogenesis. Journal of Experimental Biology. 211, 2638-2646;
24. F. Garofalo, D. Pellegrino, D. Amelio, B. Tota. (2009). The Antarctic hemoglobinless icefish, fifty five years later: A unique cardiocirculatory interplay of disaptation and phenotypic plasticity. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 154, 10-28;
25. S. Austin, J. St-Pierre. (2012). PGC1  and mitochondrial metabolism — emerging concepts and relevance in ageing and neurodegenerative disorders. Journal of Cell Science. 125, 4963-4971.

Креатин, креатинин. Биосинтез креатина и креатинина — КиберПедия

Креатин и креатинин – важные компоненты остаточного азота, в синтезе которых принимают участие аминокислоты аргинин, глицин и метионин.

В почечной ткани при участии фермента трансамидиназы, переносящего амидиновый остаток аргинина на глицин) образуется предшественник креатина – гуанидин уксусная кислота, которая подвергается метилированию в печени. С током крови креатин доставляется из печени в мышечную ткань, где происходит его фосфорилирование под влиянием креатинкиназы. Макроэрг креатинфосфат, образованный в митохондриях миоцитов, перемещается к миофибриллам, где происходит его разрушение с выделением утилизуруемой сократительными волокнами порции энергии, а также остатка неорганического фосфора и молекулы воды. Дегидратированный креатин – креатинин, будучи беспороговым веществом, выделяется с мочой. Уровень его содержания в крови и моче определяется в основном мышечной массой и выделительной способностью почек.

И креатин, и креатинфосфат найдены в мышцах, мозге и крови. Креатинифосфат в мышцах путем спонтанной неферментной потери фосфата, H₂O превращается в креатинин, который выделяется почками, и уровень выделения (клиренс креатинина) – мера их функциональных возможностей. Удаление креатинина представляет собой путь значительных потерь организмом метильных групп, используемых в синтезе многих органических молекул.

Лекция № 7.

ТЕМА «ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИНОВ В ОРГАНИЗМЕ».

Содержание темы:

1. Гемоглобин, миоглобин. Строение, функции, отличия, биологическое значение для организма.

2. Синтез гема. Распад гемоглобина в организме.

3. Желтухи. Лабораторные показатели желтух.

 

Представителем хромопротеидов является

Гемоглобин и миоглобин.

Гемоглобин – состоит из белка глобина и небелковой части гема, в составе которого имеется атом Fе(II). Молекула Нb содержит 4 гема и является белком с четвертичной структурой (4 субъединицы – 2 α-цепи и 2 β-цепи, каждая из которых имеет свою третичную структуру и особым образом уложена вокруг кольца гема). Каждая из субъединиц похожа на молекулу миоглобина. Молекула гемоглобина способна присоединять 4 молекулы О₂. Гемоглобин переносит кислород от легких к тканям, а углекислый газ в обратном направлении. Нb + О₂ → НbО₂ – оксигемоглобин – в капиллярах легких Нb насыщается кислородом при высоком парциальном давлении (100 мм рт. ст.).

В капиллярах тканей, где парциальное давление кислорода низкое (5 мм рт. ст.) НbО₂ → на Нb и О₂. Кислород переходит в ткани, а освободившийся Нb соединяется с поступившим из тканей СО₂ и превращается в НbСО₂ – карбгемоглобин, который переносится с кровью к легким. В легочных капиллярах НbСО₂ → Нb + СО₂. СО₂ выводится из организма при выдыхании, а Нb вновь насыщается кислородом.

Сравнение зависимости насыщения от парциального давления кислорода показывает, что при парциальных давлениях кислорода, характерных для тканей, гемоглобин отдает значительные количества кислорода. В гемоглобине происходит перемещение атома железа в плоскость гема с одновременным изменением конформации полипептидной цепи, но так как молекула Нb имеет четвертичную структуру и отдельные цепи связаны между собой, то это позволяет передать изменения конформации на область связи между полипептидными цепями. Это изменяет положение в пространстве всей молекулы и облегчает доступ О₂ к остальным гемам молекулы Нb. Одновременно это изменение конформации сопровождается появлением на поверхности групп, которые, диссоциируя, отдают протоны (Н⁺) в окружающую среду. При понижении парциального давления кислорода события повторяются в обратном направлении: отдача кислорода идет по мере снижения парциального давления, гемоглобин переходит в другое конформационное состояние, при этом из окружающей среды (ткань), где высока концентрация протонов, протоны присоединяются к гемоглобину. Такие изменения конформации позволяют гемоглобину не только регулировать обеспечение кислородом тканей, но и участвовать в поддержании кислотно-основного равновесия в организме.

При отравлении угарным газом в крови образовывается карбоксигемоглобин Нb + СО → НbСО – прочное соединение, препятствует образованию НbО₂ и транспорту кислорода. Возникает кислородное голодание.

Различные формы Нb определяются методом спектрального анализа. У взрослого человека молекула НbА (2 α-цепи и 2 β-цепи). Но от целого ряда условий состав цепей гемоглобина может меняться. У плода НbF (фетальный – 2 α-цепи, 2 γ-цепи) – он лучше связывает кислород при его относительной недостаточности в период внутриутробного развития.

В результате определенных нарушений генетического аппарата клетки Нb патологический, а заболевания – гемоглобинопатии наследственного происхождения.

Классическим примером является серповидно-клеточная анемия(аномальный гемоглобин – причина). Синтезируется β-цепь необычного состава, в которой валин занимает место глутаминовой кислоты, присутствующей в нормальном НbА. Изменение такое вызывает нарушение структуры и свойств Нb, который обозначается НbS – он легко выпадает в осадок, обладает сниженной способностью переносить кислород. В результате эритроциты, содержащие НbS приобретают форму серпа. Клинически: нарушается кровообращение и дыхание, иногда летальный исход.

Миоглобин – хромопротеид, содержащийся в мышцах. Он обладает простетической группой – гемом, циклическим тетрапирролом, придающим ему красный цвет. Тетрапиррол состоит из 4 пиррольных колец, соединенных в плоскую молекулу метиленовыми мостиками. Атом железа занимает центральное положение в этой плоской молекуле. Железо в составе гема цитохромов способно менять свою валентность, в гемоглобине и миоглобине изменение валентности железа нарушает их функцию. Главная функция и гемоглобина и миоглобина – связывание кислорода.

Миоглобин – сферическая молекула, состоит из 153 аминокислот с общей молекулярной массой 17000. он состоит из одной цепи, аналогичной субъединице Нb. На уровне вторичной структуры он образует 8 α-спиральных участков, захватывающих почти 75% всех аминокислот молекулы. Атом железа в геме миоглобина, не связанный с кислородом, выступает из плоскости молекулы на 0,03 нм. В оксигенированной форме атом железа как бы погружается в плоскость молекулы гема. Образуя связь с одной из молекул гистидина глобиновой части, железо при соединении с кислородом изменяет и конформацию белка. Миоглобин удобен для хранения кислорода, но не удобен для транспорта его по крови. Это объясняется процессом насыщения миоглобина в зависимости от парциального давления кислорода. Так как в легких парциальное давление кислорода 13,3 кПа, миоглобин хорошо бы насыщался кислородом, но в венозной крови это давление составляет 5,3 кПа, а в мышцах ещё меньше – 2,6 кПа. Миоглобин в таких условиях сможет отдавать мало кислорода и будет недостаточно эффективен в транспорте кислорода от легких к тканям.

Гем –простетическая группа многих важных с точки зрения функций белков.

Гем – небелковая часть, в составе находится Fе (ΙΙ), гем входит в состав флавопротеинов, гемопротеидов, гемоглобина, миоглобина, каталазы, пероксидазы, цитохромов.

Знание вопросов биосинтеза и распада гема призвано помочь в понимании роли гемопротеинов в организме. Нарушение этих процессов связано с развитием заболеваний. Так, с нарушением биосинтеза гема связана группа заболеваний – порфирии.

Порфирии – группа заболеваний с нарушением биосинтеза гемма. группа заболеваний с нарушением биосинтеза гемма. Наблюдается накопление побочных промежуточных продуктов, которые откладываются в различных органах или выделяются в повышенных количествах с калом или мочой. Появление в моче в значительных количествах веществ незавершенного синтеза гемма либо продуктов его распада (копропорфирин и уропорфирин) вызывает порфиринурию. Моча пурпурно-красного цвета. Это бывает при некоторых поражениях печени, кишечных кровотечениях, интоксикациях. Порфиринурия является одним из признаков отравления свинцом, когда нарушается транспорт Fe, необходимого для синтеза гемоглобина.

Гораздо чаще встречаются патологические состояния, связанные с распадом гема и нарушением выведения из организма продуктов его катаболического превращения. Наиболее распространенной является желтуха.

 

Из многих представителей хромопротеидов для человека наибольшее значение имеет гемоглобин. Хромопротеиды растительного и животного происхождения, находящиеся в пищевых продуктах, подвергаются действию ферментов пищеварительного тракта.

Гемоглобин пищи, находящийся в ней в денатурированном состоянии, легко гидролизуется, распадаясь на простетическую группу и белок. Белок расщепляется пепсином и трипсином с образованием пептидов и аминокислот. Следовательно, глобиновая часть гемоглобина подвергается обычным превращениям в ЖКТ, которые свойственны простым белкам. Простетическая группа – гемм – окисляется в гематин. Гематин всасывается в кишечнике очень плохо. Эти пигменты выделяются с калом частью в неизмененном виде, частью в виде различных продуктов, образующихся под влиянием бактерий кишечника. Обычные химические способы обнаружения крови в кале, имеющие большое значение для клиники, основаны на реакциях гематина, и могут дать достоверные результаты только в том случае, если диета не содержит мяса, в котором присутствует миоглобин.

Время жизни эритроцитов у взрослого организма составляет около 4 месяцев. Спустя этот период времени эритроциты разрушаются в основном в печени, селезенке и костном мозге. В ходе разрушения из эритроцитов высвобождается гемоглобин (8 – 9 г в сутки).

Biochemistry, Myoglobin — StatPearls — NCBI Bookshelf

Введение

Миоглобин — это белок, расположенный в основном в поперечно-полосатых мышцах позвоночных. MB — это ген, кодирующий миоглобин у человека. Он кодирует одну полипептидную цепь с одним сайтом связывания кислорода. Миоглобин содержит простетическую группу гема, которая может обратимо связываться с кислородом. Организм использует его в качестве белка для хранения кислорода в мышцах. Он способен связывать и выделять кислород в зависимости от концентрации кислорода в клетке.В результате его основная функция — снабжать миоциты кислородом. Миоглобин также участвует в гемостазе оксида азота. Он также играет роль в детоксикации активных форм кислорода. Миоглобин является причиной красного цвета мышц у большинства позвоночных. [1] [2]

Основы

Миоглобин — один из членов суперсемейства глобинов, в которое также входит гемоглобин. Его часто сравнивают структурно и функционально с гемоглобином. Гемоглобин имеет четыре полипептидных цепи и четыре участка связывания кислорода.Миоглобин представляет собой единую полипептидную цепь с одним сайтом связывания кислорода, что приводит к разной кинетике связывания двух белков с кислородом. Миоглобин делает это некооперативно, в отличие от гемоглобина, который связывается с кислородом кооперативно в результате своей тетрамерной природы. В результате кривая насыщения миоглобина кислородом является гиперболической. Гемоглобин имеет сигмовидную кривую из-за его кооперативного связывания. Миоглобин проявляет более высокое сродство к кислороду, чем гемоглобин. Следовательно, он очень эффективно извлекает кислород из крови.Миоглобин в основном присутствует в поперечно-полосатой мышце позвоночных. Гемоглобин, с другой стороны, находится в кровотоке в составе эритроцитов. Миоглобин также присутствует в гораздо более низких концентрациях в гладкомышечных, эндотелиальных и даже опухолевых клетках. [1] [2]

Проблемы, вызывающие озабоченность

Роль миоглобина как маркера заболевания ограничена. Его больше нет в конкретных рекомендациях по ведению острых коронарных синдромов. Что касается рабдомиолиза, миоглобин не является прогностическим критерием и не является диагностическим.[3]

Клеточный

Миоглобин наибольшая концентрация встречается в поперечно-полосатых мышцах позвоночных. В частности, он находится в цитоплазме сердечных миоцитов и саркоплазме окислительных волокон скелетных мышц; это включает скелетную мышцу и сердечную мышцу. Миоглобин также присутствует в гораздо более низких концентрациях в гладкомышечных и эндотелиальных опухолевых клетках. [2]

Об экспрессии гена MB также сообщалось в различных линиях опухолевых клеток, таких как карцинома груди, карцинома толстой кишки, острый лейкоз, десмопластические мелкоклеточные опухоли и немелкоклеточный рак легкого.[4]

Molecular

Миоглобин представляет собой одну полипептидную цепь из 154 аминокислот. Цепочка состоит из восьми α-спиралей, обозначенных буквами A – H. Молекула содержит простетическую группу гема, в которую входит ион железа с порфириновым кольцом. Связанный с гемом катион Fe может существовать в состоянии 2+ (восстановленное) или 3+ (окисленное). Сам ион железа взаимодействует с шестью различными лигандами, один из которых служит местом связывания кислорода. Этот сайт связывания также может связываться с другими потенциальными молекулами, включая CO и NO.[1]

Функция

Основная функция миоглобина — снабжать мышцы кислородом. Он делает это, высвобождая кислород в митохондрии, составляющие дыхательную цепь, помогая миоцитам удовлетворять свои высокие потребности в энергии. Миоглобин служит буфером для концентрации внутриклеточного кислорода и резервуаром кислорода в мышцах. Эта концепция подтверждается тем фактом, что ныряющие млекопитающие могут иметь в 10-30 раз больше миоглобина по сравнению с животными, которые не задерживают дыхание в течение длительного периода.[1]

Миоглобин способствует диффузии кислорода. Миоглобин обесцвечивается в начале мышечной активности, что увеличивает градиент диффузии кислорода из капилляров в цитоплазму.

Было также показано, что миоглобин выполняет ферментативные функции. Это необходимо для разложения биологически активного оксида азота до нитрата. Удаление оксида азота усиливает дыхание митохондрий. Это усиление связано с тем, что оксид азота обратимо ингибирует цитохромоксидазу.

Миоглобин, кроме того, удаляет активные формы кислорода.Он может делать это, взаимодействуя с жирными кислотами, которые могут иметь метаболическое значение в условиях насыщения кислородом и высоких энергозатрат [2].

Механизм

Миоглобин содержит катион Fe (II), связанный с гемовой группой, что дает ему способность обратимо связываться с кислородом. Кислород может связываться с гемовым остатком миоглобина из-за взаимодействия иона железа с шестью лигандами. Четыре из этих лигандов представляют собой атомы азота, которые вместе образуют порфириновое кольцо и имеют общую плоскость с железом.Пятый лиганд представляет собой имидазольную боковую цепь His93, которая стабилизирует гемовую группу и немного смещает ион железа от плоскости. Шестое положение лиганда — это сайт связывания кислорода. Когда кислород связывается с ионом железа, он частично возвращается в плоскость порфиринового кольца. Миоглобин также может связывать альтернативные лиганды, такие как молекулы CO, нитрита и азида. Например, CO прочно связывается с миоглобином так же, как и с гемоглобином, который образует карбоксимиоглобин. [1]

В восстановленной форме Fe (II) миоглобин может быть связан с кислородом (оксимиоглобин) или нет (дезоксимиоглобин).Кроме того, ион железа может окисляться с образованием Fe (III), известного как метмиоглобин. Связывание кислорода происходит без взаимодействия, поскольку миоглобин является мономерным. [5] Это связывание является причиной того, что кривая насыщения миоглобина кислородом является гиперболической и характерной для нормальной кинетики фермента Михаэлиса-Ментен. Сигмовидная форма кривой насыщения гемоглобина кислородом обусловлена ​​его тетрамерным составом и кооперативным связыванием кислорода.

Тестирование

Тестирование миоглобина может происходить в крови или моче.Основные показания для проверки этой лаборатории — рабдомиолиз или инфаркт миокарда. Как указано выше, полезность этих тестов сомнительна.

Что касается рабдомиолиза, определение миоглобина в моче можно проводить с помощью тест-полоски мочи и микроскопии. При этом заболевании вы получите положительный результат анализа мочи на кровь. Однако, если посмотреть на образец под микроскопом, не будет никаких доказательств наличия красных кровяных телец. Индикаторная полоска мочи показывает ложный положительный результат на кровь, потому что миоглобин также реагирует с реагентом для теста ортотолидин.Миоглобин сыворотки не требуется для диагностики или лечения рабдомиолиза. Миоглобин в моче также обычно не используется. [6] Анализ мочи может надежно предсказать отсутствие миоглобинурии. Этот тест можно использовать вместо определения миоглобина в моче. [7]

Кроме того, миоглобин является чувствительным маркером острого инфаркта миокарда. Однако в нем нет конкретики. Его полезность заключается в оценке размера инфаркта и реперфузии. Миоглобин быстро высвобождается из миокарда во время травмы, и его концентрация в крови повышается в течение 30 минут сразу после начала события.Это один из первых маркеров, повышающихся в результате ишемической болезни сердца. Затем он быстро выводится почками в течение 24 часов. В этом смысле это важный маркер для раннего выявления или исключения сердечного повреждения. Таким образом, использование этого биомаркера инфаркта миокарда должно быть в сочетании с другими критериями в пользу диагностики инфаркта миокарда. В текущих условиях отделения неотложной помощи миоглобин не является частью диагностических критериев. Тропонины, Hs-cTnI и hs-cTnT, в настоящее время являются золотым стандартом биомаркеров.[8]

Патофизиология

Модели нокаута миоглобина были созданы, чтобы попытаться лучше понять его функции. Мышиные модели мутировали миоглобин до такой степени, что его невозможно обнаружить в сердечных и скелетных мышцах. Мутация вызывает у эмбрионов несколько летальных сердечно-сосудистых дефектов. Однако мыши, пережившие эту стадию развития, проявили клеточные и молекулярные адаптивные ответы, чтобы справиться с недостатком миоглобина. К ним относятся наличие более высокой плотности капилляров в сердце для улучшения снабжения кислородом.Их результаты, наряду с другими аналогичными исследованиями, предполагают, что, хотя существуют компенсаторные реакции, миоглобин необходим для нормального развития и функционирования мышц. [9]

Миоглобин также играет роль в патофизиологии рабдомиолиза. Процесс начинается с повреждения мембраны миоцита или изменения выработки энергии; это приводит к притоку внеклеточного кальция вместе с высвобождением кальция из саркоплазматической сети и митохондрий изнутри клетки. Накопление избыточного внутриклеточного кальция вызывает деструктивные процессы, приводящие к лизису клетки и высвобождению ее содержимого, в том числе миоглобина.Этот белок является основным компонентом мышц, который способствует повреждению почек. Первым предполагаемым механизмом его токсичности является обструкция канальцев. Миоглобин может выпадать в осадок из раствора в почечных канальцах. Это усугубляется истощением внутрисосудистого объема и ацидозом. Второй механизм — повреждение окислителем. Железо в миоглобине может диссоциировать и приводить к высвобождению свободных радикалов и окислительному повреждению почечной паренхимы. Последний механизм заключается в том, что миоглобин вызывает перекисное окисление липидов.Этот процесс создает молекулы, которые действуют как вазоконстрикторы для почечных артериол. [10]

Клиническая значимость

Основное клиническое значение миоглобина связано с его ассоциацией с повреждением мышц. В частности, это коррелирует с рабдомиолизом и инфарктом миокарда. Это не болезненные процессы, возникающие из-за дефектного миоглобина, а скорее процессы, которые заставляют миоглобин просачиваться в кровь и мочу, вызывая повреждение. Рабдомиолиз ассоциируется с миоглобинурией и часто острым повреждением почек.Первое описание рабдомиолиза связано с травмами и травмами. Однако у госпитализированных пациентов более частые причины включают в себя безрецептурное, рецептурное и незаконное употребление наркотиков и алкоголя. Судороги также могут вызывать рабдомиолиз. [11] Чрезмерное выделение миоглобина с мочой может привести к изменению цвета на красный или коричневый. Жидкая реанимация — основное вмешательство при лечении острого повреждения почек, вызванного миоглобином. [10]

Миоглобин также обнаруживается в моче в результате наследственных миопатий.Для их выявления может быть сделана биопсия мышцы, если она выполняется после эпизода рабдомиолиза, вызванного физической нагрузкой. Однако предпочтительным диагностическим тестом является молекулярная генетика. [12]

Миоглобин определяется в сыворотке крови после острого инфаркта миокарда. Однако, как описано выше, в настоящее время этого нет в рекомендациях по диагностике. Это один из самых ранних сердечных биомаркеров, повышающих концентрацию в крови после инфаркта миокарда [8].

Дополнительное образование / Контрольные вопросы

Ссылки

1.

Ордуэй, Джорджия, Гарри DJ. Миоглобин: важный гемопротеин в поперечно-полосатой мышце. J Exp Biol. 2004 сентябрь; 207 (Pt 20): 3441-6. [PubMed: 15339940]

2.

Кох Дж., Людеманн Дж., Спайс Р., Ласт М., Амемия С.Т., Бурместер Т. Необычное разнообразие генов миоглобина у двустворчатых рыб. Mol Biol Evol. 2016 декабрь; 33 (12): 3033-3041. [PubMed: 27512111]

3.

Сервонне А, Дубост С., Мартин Дж., Лефрер Б., Фонтан Э, Сеппа Ф., Делакур Х. Миоглобин: все еще полезный биомаркер в 2017 году? Анн Биол Клин (Париж).2018, 01 апреля; 76 (2): 137-141. [PubMed: 29623882]

4.

Бикер А., Дитрих Д., Глейкснер Е., Кристиансен Г., Горр Т.А., Ханкельн Т. Обширная сложность транскрипции во время регулируемой гипоксией экспрессии гена миоглобина при раке. Hum Mol Genet. 2014 15 января; 23 (2): 479-90. [PubMed: 24026678]

5.

Silverstein TP, Kirk SR, Meyer SC, Holman KL. Структура и функция миоглобина: проект лаборатории биохимии, рассчитанный на несколько недель. Биохим Мол Биол Образов. 2015 май-июнь; 43 (3): 181-8.[PubMed: 25726810]

6.

Sauret JM, Marinides G, Wang GK. Рабдомиолиз. Я семейный врач. 01 марта 2002; 65 (5): 907-12. [PubMed: 11898964]

7.

Schifman RB, Luevano DR. Значение и использование анализа мочи при миоглобинурии. Arch Pathol Lab Med. 2019 ноя; 143 (11): 1378-1381. [PubMed: 31116043]

8.

Айдын С., Угур К., Айдын С., Сахин И., Ярдим М. Биомаркеры острого инфаркта миокарда: современные перспективы. Vasc Health Risk Manag. 2019; 15: 1-10.[Бесплатная статья PMC: PMC6340361] [PubMed: 30697054]

9.

Мисон А.П., Рэдфорд Н., Шелтон Дж. М., Маммен П. П., ДиМайо Дж. М., Хатчесон К., Конг И., Элтерман Дж., Уильямс Р. С., Гарри Д. Д.. Адаптивные механизмы, сохраняющие сердечную функцию у мышей без миоглобина. Circ Res. 2001, 13 апреля; 88 (7): 713-20. [PubMed: 11304494]

10.

Zimmerman JL, Shen MC. Рабдомиолиз. Грудь. 2013 сентябрь; 144 (3): 1058-1065. [PubMed: 24008958]

11.

Zutt R, van der Kooi AJ, Linthorst GE, Wanders RJ, de Visser M.Рабдомиолиз: обзор литературы. Нервно-мышечное расстройство. 2014 августа; 24 (8): 651-9. [PubMed: 24946698]

12.

Barca E, Emmanuele V, DiMauro SB. Метаболическая миоглобинурия. Curr Neurol Neurosci Rep.2015 Октябрь; 15 (10): 69. [PubMed: 26319173]

Миоглобин — обзор | ScienceDirect Topics

Миоглобин (Mb) — гемсодержащий глобулярный белок, который в большом количестве обнаружен в клетках миоцитов сердца и скелетных мышц. Mb и Mb-подобные белки также встречаются во многих таксонах, включая бактерии, растения, грибы и животных.В 1958 году было сообщено о структуре Mb кашалота с помощью дифракции рентгеновских лучей (разрешение 6 Å, уточнено до 2 Å в 1960 году), это первая трехмерная структура, полученная для любого белка. Mb кашалота, как и большинство Mbs млекопитающих, имеет молекулярную массу около 17 кДа и состоит из одной полипептидной цепи из примерно 153 аминокислот со вторичной структурой из восьми α -спиралей (рис. 1). Между пятой и шестой спиралями находится гидрофобная область, которая действует как карман для гемовой составляющей (Fe-протопорфирин-IX).Железо гема координируется с четырьмя атомами азота порфиринового кольца и с белком через азот аминокислотного остатка гистидина. Шестой координационный центр гемового железа доступен для связывания экзогенных молекул, таких как кислород, окись углерода (57), цианид, вода, в зависимости от валентного состояния железа. В физиологически активном состоянии окисления двухвалентного железа (Fe ^II ) железо может обратимо связывать кислород. В отличие от своего гетеротетрамерного гемоглобина «кровного родства» (Hb), мономерный Mb не проявляет кооперативного связывания кислорода, имея коэффициент Хилла 1 по сравнению с 2.8 для Hb (рисунок 2). Mb имеет более высокое сродство к кислороду, чем Hb, и, следовательно, для высвобождения кислорода требуется низкое давление кислорода. Многие учебники называют Mb как молекулу, запасающую кислород, или как дополнительный резерв кислорода. Хотя Mb определенно способна накапливать кислород, общая емкость Mb по хранению кислорода мала по сравнению с потребностями в кислороде активных мышц, таких как сердце. Совсем недавно было высказано предположение, что Mb облегчает диффузию кислорода вниз по градиенту кислорода, увеличивая транспорт кислорода к митохондриям, где кислород потребляется респираторным ферментом цитохромоксидазой.Несмотря на очевидную важность в транспорте кислорода, мыши с нокаутом Mb не обнаруживают явного фенотипа. Эти «белые мышцы» мыши способны нормально функционировать без Mb, но демонстрируют несколько компенсаторных механизмов, включая повышенную плотность сердечных капилляров, коронарный кровоток и Hb. Это приводит к уменьшению длины пути диффузии для O ₂ между капилляром и митохондриями.

Рис. 1. (a) Трехмерная ленточная модель миоглобина кашалота, показывающая гем-группу и проксимальный гистидин, которые связывают железо гемовой группы с белком.(б) В дезокси-состоянии железо вытягивается из плоскости гема проксимальным гистидином. Связывание кислорода вытягивает железо обратно в плоскость гема.

Рис. 2. Кривые насыщения кислородом миоглобина и гемоглобина.

Миоглобин — обзор | Темы ScienceDirect

4.3.1 Миоглобин

Мономерный гем-белок миоглобин отвечает за доставку и хранение двуокиси кислорода в мышечной ткани. Существует несколько типов мышечных волокон, которые различаются по своему распределению, функциям и способам производства АТФ [56,57].Мышечные волокна типа I богаты кровяными капиллярами, митохондриями и миоглобином. Они производят АТФ путем окислительного фосфорилирования, что делает их устойчивыми к усталости. Мышечные волокна типа II производят АТФ в гликолитическом цикле. Существует несколько подтипов волокон типа II. Количество митохондрий и миоглобина является самым высоким в типе IIA и промежуточным в типе IIX, тогда как в волокнах типа IIB присутствует только несколько митохондрий и миоглобин. Мышечные волокна типов I и IIA важны для длительной нагрузки, тогда как волокна типа IIB имеют более высокую скорость сокращения.Однако последние волокна не устойчивы к усталости, поскольку они вырабатывают энергию из предварительно накопленного гликогена.

В отличие от гемоглобина миоглобин является мономерным белком только с одной гемовой группой. Кислород связывается с миоглобином двухвалентного железа гораздо сильнее, чем с двухвалентным гемоглобином [58]. Различия и сходства между гемоглобином и миоглобином приведены в таблице 4.1. Это позволяет накапливать кислород в мышцах для интенсивных упражнений и служит резервуаром для кислорода во время гипоксии.В отличие от гемоглобина, миоглобин демонстрирует кривую связывания диоксида гиперболической формы, которая соответствует кинетике Михаэлиса-Ментен [58,59]. Это сильное связывание O ₂ позволяет функционированию миоглобина буферизовать внутримышечную концентрацию O ₂ в условиях повышенной метаболической активности. Кроме того, миоглобин облегчает и опосредует диффузию O ₂ из кровеносных сосудов в митохондрии [56,63]. Для доставки O ₂ в митохондрии необходим прямой контакт между оксигенированным миоглобином и митохондриями [64].

Таблица 4.1. Различия и сходства между гемоглобином и миоглобином.

901 Профирин 9016 Геме-орфин 9016 NO

Свойство	Гемоглобин	Миоглобин	Литература
Структура белка	Тетрамер	Мономер IX			Мономер IX IX		Связывание O 2		Сильнее, чем гемоглобин	[58]
Кривая связывания с O 2	Сигмоидальная форма	Гиперболическая форма		901,58,5	Кооперативность O 2 связывание	Да	Нет	[6]
Автоокисление	Двухфазное, более устойчивое по сравнению с миоглобином		[9]
Есть	[45,46,60]
Уменьшение т Гем железа	Метгемоглобинредуктаза в красных кровяных тельцах	Метмиоглобинредуктаза в мышцах	[20,61,62]

Подобно гемоглобину, миоглобин быстро окисляется, главным образом, NO до метмиоглобина после его высвобождения из поврежденных мышц.Метгемоглобин не может связывать дикислород. В мышцах, но не в крови, железистая форма миоглобина поддерживается за счет активности НАДН-зависимой метмиоглобинредуктазы [61,62,65].

В кардиомиоцитах миоглобин также способствует гомеостазу NO [60]. В нормоксических условиях оксигенированный миоглобин связывает NO и превращается в метмиоглобин. Метмиоглобинредуктаза перерабатывает миоглобин железа. Этот механизм защищает митохондриальное дыхание от ингибирования NO. При уменьшении поступления O ₂ деоксигенированный миоглобин становится доминирующей формой.Восстанавливает нитрит до NO при образовании метмиоглобина. В результате митохондриальные цитохромы обратимо ингибируются NO, потребление O ₂ миокардом снижается, и сердечная мышца адаптируется к ограниченному поступлению O ₂ .

Миоглобин — протеопедия, жизнь в 3D

Функция

Миоглобин — глобулярный белок, функция которого заключается в хранении молекулярного кислорода в мышцах (мио = мышцы) ^[1] . Он состоит из двух основных компонентов: одиночной полипептидной цепи и гемового лиганда.Гем-лиганд находится только на поверхности; большая часть его похоронена внутри белка. В целом миоглобин имеет форму диска с диаметром, примерно в два раза превышающим его толщину. Общая складка белка сохраняется, особенно ядро ​​белка (показано фиолетовым цветом), но последовательность больше на поверхности. Метмиоглобин (MMb) — это окисленная форма миоглобина.

Структурные особенности

Глобин состоит в основном из альфа-спиралей, показанных на; у него нет бета-листов, и его неспиральные сегменты в основном служат звеньями, соединяющими спирали.Посмотрите вниз на ствол некоторых из более длинных спиралей. Все ли они натуралы? Обозначены восемь структурно консервативных альфа-спиралей. На этом изображении белок окрашен в виде радуги N -> C; конец N синий, а конец C красный.

Именно атом железа в середине гема связывает кислород в миоглобине. В этом представлении только гем показан в форме шара и палочки с его атомами C, N и O, отображаемыми как серые, синие и красные шары соответственно.Атом железа показан оранжевым цветом и находится в режиме заполнения пространства, чтобы лучше проиллюстрировать его взаимодействие с гемом. Железо связано четырьмя атомами азота, содержащимися в гемовом кольце, а также одним атомом из белковой цепи. Какая аминокислота из белка миоглобина связывается с железом? Обратите внимание, что в насыщенном кислородом состоянии железо находится в плоскости гемового кольца. В состоянии (без кислорода) атом Fe находится немного выше плоскости гема, а второй координируется с железом в гемовом кольце.

Дополнительная информация

Оксимиоглобин для миоглобинового комплекса с O2
Порфирин для порфирина.
Molecular Playground / Myoglobin
Myoglobin of Physeter catodon: структура
Extremophile
Extremophiles

Myoglobin-Physeter-catodon-structure (испанский)
Myoglobin (иврит)
Myoglobin (арабский).

3D-структуры миоглобина

3D-структуры миоглобина

Миоглобинопатия — это аутосомно-доминантная миопатия у взрослых с характерными саркоплазматическими включениями

Пациенты

14 пациентов, описанных в этом исследовании, составляют клинически и патологически однородную когорту взрослых пациентов, принадлежащих к шести неродственным семьям (F1 – F6), ( Инжир.1), происходящие из Испании (2), Швеции (1), Франции (2) и Нидерландов (1). Семьи были идентифицированы в основном по их очень характерным чертам при биопсии мышц. Клинические и патологические особенности шведской семьи описаны ^34,35 , а голландский пациент кратко описан в отчете семинара ⁴⁰ .

Исследование было одобрено комитетами по этике участвующих учреждений: IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Karolinska Institutet, Университет Западной Австралии, Institut de Myologie, GHU Pitié-Salpêtrière, Hospices Civils de Lyon, Университетские больницы Лёвена и Университет Анри Мондора. Забор в больнице проб проводился с письменного информированного согласия пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Биопсия мышц

Биопсия мышц проводилась по крайней мере у одного больного пациента на семью после письменного информированного согласия (дополнительная таблица 1). Кроме того, посмертные образцы сердечной, скелетной и диафрагмальной мышц были получены от индивидуумов F1, II: 7, а посмертные сердечные и скелетные мышцы были получены от индивидуума F3: III: 5. Образцы были обработаны для рутинного гистохимического анализа и на кислую фосфатазу активность и краситель берлинской синей Перлза и ализариновый красный для обнаружения железа и кальция соответственно.Иммуногистохимический анализ проводили на миоглобин, убиквитин, p62 и LAMP1. Срезы криостата толщиной 8 мкм инкубировали с 1% перекисью водорода в 1 × PBS (фосфатный буферный раствор) в течение 5 минут для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем реакции неспецифического связывания блокировали 10% (коза) или 3% (лошадь) нормальной сывороткой в ​​1 × PBS в течение 2 часов с последующей инкубацией соответствующего первичного антитела, разведенного в 1 × PBS с 3% (козий) или 1%. (лошадь) нормальная сыворотка при 4 ° C в течение ночи. Мышиные моноклональные анти-миоглобин (Novus Biology), анти-LAMP1 (Santa Cruz Biotechnology, H-228: sc-5570), кроличьи поликлональные антиубиквитины (Dako, z-458) и поликлональные антитела морских свинок против С-конца p62 (Progen, GP62-C) использовали в разведении 1:50, 1: 100, 1: 100 и 1: 100 соответственно.После промывки срезы обрабатывали с помощью системы обнаружения Super Sensitive Link-Label IHC (BioGenex) в соответствии с инструкциями производителя. Поскольку саркоплазматические тельца имеют коричневый цвет, а иммунореакции диаминобензидина (DAB) выглядят коричневыми, иммунореакции визуализировались в виде темно-синего осадка с использованием NH ₄ NiSO ₄ , разбавленного в фосфатном буфере с 0,03% DAB, 0,04% NH ₄ Cl и 0,001% перекиси водорода ⁴¹ . Срезы просматривали с помощью микроскопа Olympus BX43.Неокрашенные срезы также исследовали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS-SL в широком диапазоне видимых линий лазерного возбуждения. Небольшой образец биопсийной ткани фиксировали в 2% глутаровом альдегиде, затем фиксировали 1% тетроксидом осмия и заливали аралдитом. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали с помощью электронного микроскопа JEOL 1011 и фотографировали с помощью камеры gatan 782.

Молекулярная генетика — две испанские семьи

Целевой захват и секвенирование следующего поколения (ProtonTM, Life Technologies) 336 генов, включая 254 гена нервно-мышечных заболеваний, перечисленных в таблице генов нервно-мышечных заболеваний на конец декабря 2012 г. (www.Musclegenetable.fr) проводилась у пробандов из семей F1 и F2. Обогащение экзома выполняли на ДНК пробанда (с использованием набора Ampliseq Whole Exome, Thermofisher Scientific). Вкратце, всего 100 нг ДНК амплифицировали в 12 отдельных пулах ПЦР, каждый из которых содержал ~ 25000 пар праймеров при следующих условиях: 99 ° C в течение 2 минут с последующими 10 циклами при 99 ° C в течение 15 с и 60 ° C. на 16 мин. После амплификации отдельные реакции объединяли и расщепляли с использованием поставляемого фермента FuPa, который разрушает праймеры ПЦР.Затем были лигированы адаптеры секвенирования со штрих-кодом, и библиотека была очищена с использованием гранул AMPure (Beckman Coulter) и амплифицирована в течение пяти циклов с использованием высокоточной полимеразы Platinum. Конечную амплифицированную библиотеку снова очищали с использованием гранул AMPure и анализировали на 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies). Библиотеки разводили до 18–26 пМ. Присоединение к частицам Ion Sphere было выполнено с помощью набора Ion Proton Template 200 V3. Секвенирование выполняли на чипах для секвенирования P1 (520 потоков) с использованием секвенатора Ion Proton и набора Ion Sequencing 200 V3.После объединения два образца секвенировали на одном чипе. После секвенирования для удаления низкокачественных оснований с 3 ’конца считывания были обрезаны. Считывания были сопоставлены с эталонной последовательностью генома (Hg19) с помощью tmap (Torrent Suite 4.2). Вызывающий Torrent Variant использовался для вызова вариантов с пользовательскими настройками, оптимизированными для exome. Ion Reporter 4.0 использовался для аннотирования данных. Фильтрация вариантов проводилась с помощью ANNOVAR по трем базам данных: ENCODE GENECODE v.19, 1000 геномов (порог> 0,5%), dbSNP138, а также по списку общих внутренних вариантов ⁴² .Отфильтрованные данные экзома были опрошены на предмет вариантов в наборе генов, которые были наиболее высоко обогащены (> 1000 раз) в образцах скелетных мышц в наборе данных FANTOM5 (функциональная аннотация генома млекопитающих) ⁸ . Используя атлас экспрессии на уровне промотора FANTOM5, мы составили ранжированный список генов, обогащенных скелетными мышцами. Исходный файл с предварительно вычисленным относительным выражением был загружен с http://fantom.gsc.riken.jp/5/tet/data/hg19.cage_peak_phase1and2combined_rel_expr.txt.gz. Мы определили промотор для каждого гена с наиболее высокой экспрессией в 76 образцах скелетных мышц и сравнили его со средней экспрессией во всей коллекции FANTOM5 [log10 (максимальная экспрессия в любом образце скелетных мышц + 1) —log10 (медиана экспрессии в FANTOM5 сборник + 1)]. Был идентифицирован промотор для 82 аннотированных генов, кодирующих белок, показывающий более чем 1000-кратную экспрессию в скелетных мышцах. Тридцать один из этих генов ранее был связан с генетическим заболеванием мышц у людей.Мы выделили 51 ген, которые ранее не были связаны с мышечными заболеваниями человека, как гены-кандидаты миопатии.

Полногеномный анализ сцепления шведской семьи — Семья 3

Полногеномный анализ сцепления был выполнен с использованием генотипов 550 микросателлитных маркеров. Ошибки генотипа были проверены и удалены перед анализом с помощью PedCheck ⁴³ GENEHUNTER v. 2.1 ⁴⁴ , который использовался как для параметрического, так и для непараметрического анализа сцепления. Параметрический анализ сцепления был выполнен в предположении аутосомно-доминантной модели с пенетрантностью 0.999 для гетерозигот, частота аллелей болезни 0,001 и частота фенокопии 0,001. Показатели LOD были рассчитаны по той же доминирующей модели. Были выполнены как многоточечный, так и одноточечный анализ. Положения маркерных локусов были основаны на опубликованных генетических картах человека (Национальный центр биотехнологической информации).

Целевое секвенирование в шведской семье

Целевое секвенирование и секвенирование включало> 400 генов, окружающих пиковый многоточечный показатель LOD. Обогащение целевой области секвенирования было получено с использованием специально разработанной библиотеки NimbleGen SeqCap EZ Developer (Roche NimbleGen, Inc.Мэдисон, Висконсин 53719 США). Для целевого секвенирования были отобраны восемь образцов, два здоровых контроля и шесть пациентов из шведской семьи F3. Секвенирование было выполнено в SciLifeLab Stockholm, Швеция. Все образцы дали ожидаемое количество считываний секвенирования. Каждую библиотеку ДНК получали из 3 мкг объединенной геномной ДНК. ДНК разрезали до 300 п.н. с помощью прибора Covaris S2 и обогащали с помощью специально разработанного набора NimbleGen SeqCap. Кластеризация была выполнена в системе создания кластеров cBot с использованием набора для создания кластеров чтения с парным концом HiSeq в соответствии с инструкциями производителя.Образцы секвенировали на Illumina HiSeq 2000 при считывании парных концов до 100 п.н. Циклы секвенирования были выполнены в соответствии с инструкциями производителя. Базовое преобразование было выполнено с использованием Illumina OLB v1.9.

Секвенирование по Сэнгеру

Вариант MB c.292C> T (p.His98Tyr) был идентифицирован в семействах от F1 до F3 через NGS. Наличие варианта в этих трех семьях было подтверждено Сэнгером. Семейства F4, F5 и F6 были проверены на мутации в MB с использованием секвенирования по Сэнгеру.Исследования сегрегации были выполнены во всех семьях, включая образцы от всех доступных затронутых и здоровых родственников, с использованием секвенирования по Сэнгеру. Праймеры MB включены в дополнительные методы 1.

Прогнозы in silico

В качестве предикторов патогенности in silico использовались: MutationAssessor ⁴⁵ , MutationTaster ⁴⁶ , PolyPhen-2 ⁴⁷ , Provean ⁴⁸ и 49 .

Анализ гаплотипов

Чтобы проверить возможные эффекты основателя, мы изучили восемь информативных микросателлитных маркеров (D22S685, D22S691, D22S1152, D22S1265, ( MB ), D22S277, D22S683, D22S692, IL2RB), охватывая 338 MB) размером около 3 МБ. мультиплексная полимеразная цепная реакция с мечеными праймерами и фрагментный анализ.Для анализа фрагментов использовали программу GeneMapper. Праймеры, используемые в анализе гаплотипов, включены в Дополнительные методы 2.

Корреляционная электронная микроскопия и визуализация NanoSIMS

Для визуализации NanoSIMS (наноразмерная вторичная ионная масс-спектрометрия) — 500 нм срезы залитых смолой образцов мышц от людей F1 II: 5, и II: 7 и F2 II: 2 наносили на покрытые платиной покровные стекла, а затем переносили в сканирующий электронный микроскоп (SEM) FEI Verios для получения изображений в отраженных электронах (BSE) ⁵⁰ .Для визуализации BSE использовался электронный пучок 1-2 кВ с током ~ 100 пА. Затем срезы покрывали 5 нм платиной с помощью устройства для нанесения покрытий Polaron SC 7640 и переносили в NanoSIMS 50L (CAMECA, Франция) для химического анализа. Те же области, отображаемые с помощью SEM, были проанализированы с помощью NanoSIMS на предмет химического распределения. Первичный луч Cs ⁺ 16 кэВ используется для обнаружения ³¹ P ^—, ³² S ^— и ⁵⁶ Fe ¹⁶ O.

Для сравнительных целей в дополнение к образцам миоглобинопатии , мы выполнили анализ NanoSIMS в одном образце от пациента с болезнью Помпе, содержащем электронно-плотные включения, двух образцах, показывающих большое количество липофусцина, и двух образцах мышц от пациентов с дистальными миопатиями с окаймленными вакуолями.

Инфракрасная микроскопия с преобразованием Фурье

Криостатные срезы мышц толщиной 10 мкм были получены от индивидуумов F1, II: 5 и II: 7, F2, II: 2, F3, III: 5, II: 15 и IV: 6 и депонированы. на окнах CaF ₂ и дать высохнуть. Перед анализом с помощью инфракрасной спектроскопии образцы хранили в условиях вакуума. Эксперименты μFTIR были выполнены на канале MIRAS в синхротроне ALBA, Испания, с использованием микроскопа Hyperion 3000, соединенного со спектрометром Vertex 80 (Brucker), оснащенным объективом с 36-кратным увеличением.Диапазон измерений составлял 900-4000 см, ^-1 , а сбор спектров производился в режиме пропускания со спектральным разрешением 4 см ^-1 , размерами апертуры 10 мкм × 10 мкм с использованием детектора на основе теллурида кадмия (MCT) ртути. Для каждого спектра было добавлено 128 сканов. Фоновые спектры собирали с чистой области каждого окна CaF ₂ . Данные FTIR анализировали с использованием OPUS 7.5 (Brucker) и Origin 9.1. Спектры, демонстрирующие сильное рассеяние Ми, были исключены, и был применен второй вывод спектров, чтобы исключить базовую линию и улучшить разрешение различных полос, используя алгоритм Савицки-Голея с 15-точечным фильтром и полиномиальным порядком два.Назначение инфракрасных полос хорошо установлено для белков и липидов и показано на рис. 5c. Производная каждого FTIR-спектра была вычислена и отношения для окисления липидов (1741 см ^-1 /2925 см ^-1 , CO / -CH ₂ ) и отношения липидных белков (2925 см ^-1 /1654 см ⁻¹ Амид I / −CH ₂ ) вычислено ⁵¹ .

Экспрессия и очистка плазмид рекомбинантного WT и мутантного MB

pET-19b с WT человека, p.His98Tyr или p.His65Tyr / Val69Phe кДНК миоглобина (последняя будет использоваться для исследований кинетики потери гема, см. Ниже), клонированная в них, была куплена (GenScript USA Inc.), а затем трансформирована в Escherichia Coli BL21 (DE3) для получения меченных на N-конце слитых миоглобинов, меченных His. В среду Лурия-Бертани с добавлением ампициллина (100 мкг / мл) засевали свежеприготовленную ночную культуру (при соотношении разбавлений 1: 100). Культуру выращивали при 37 ° C при перемешивании (220 об / мин) до OD ₆₀₀ = 0.6 было достигнуто. Температуру и скорость встряхивания снижали до 20 ° C и 100 об / мин и добавляли гемин до конечной концентрации 15 мкг / мл. Через 30 мин добавляли изопропил-β-d-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 0,5 мМ. Обратите внимание, что p.His65Tyr / Val69Phe для экспериментов со скоростью потери гемина выращивали с использованием той же процедуры, но без добавления гемина. Чтобы убедиться, что двойной мутант находится в апо-форме, 3,5 мг белка при pH 2,5 экстрагировали равным объемом 2-бутанона, встряхивали три раза в течение 5 минут и затем инкубировали смесь в течение 10 минут при 4 ° C ²⁰ .Водную фазу диализовали при 4 ° C против 1 л воды, а затем против 1 л 0,2 м фосфатного буфера pH 7 или 0,2 м ацетатного буфера pH 5. Через 12 ч культуру центрифугировали, ресуспендировали в 50 мМ фосфатном буфере. 150 мМ NaCl и 20 мМ имидазол (pH 7,5), лизированные обработкой ультразвуком и осветленные центрифугированием. Белки очищали с помощью аффинной хроматографии (колонки HisTrap FF raw (GE Healthcare), подключенные к хроматографической системе AKTA Prime (Amersham Pharmacia Biotech), а затем с помощью гель-фильтрационной хроматографии (HiLoad 16/60 Superdex 75 Prepgrade (Amersham Biosciences).Чистоту фракций проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и спектроскопией в УФ-видимой области.

Тест агрегации миоглобина WT и варианта His98Tyr

MB WT и вариант His98Tyr MB инкубировали в 10 мМ фосфатном буфере при pH 7,4 при 37 ° C и 200 об / мин при перемешивании в течение 1 недели. В разное время отбирали аликвоты для измерений флуоресценции ThT и инфракрасной спектроскопии. Для обнаружения флуоресценции фибрилл к раствору добавляли тиофлавин Т (ThT) (SIGMA-Aldrich), флуоресцентный краситель, специфичный для фибрилл.В целом, исходные растворы ThT 8 мМ были приготовлены в 10 мМ фосфатном буфере при рН 7,4 буфера и профильтрованы через фильтрующий блок с приводом от шприца 0,45 мкм (Millipore). Конечная концентрация ThT во флуоресцентной кювете составляла 35 мкм. Длины волн возбуждения и излучения были установлены на 450 и 490 нм, соответственно, с использованием флуориметра PTI. Температура была 37 ° C. Для инфракрасных спектров 3 мкл различных образцов наносили на окна из CaF ₂ и сушили в вакууме. Инфракрасные спектры были измерены на канале MIRAS в синхротроне ALBA.

Электрохимические измерения

Все спектроэлектрохимические эксперименты проводились в самодельной ячейке OTTLE (оптически прозрачный тонкослойный спектроэлектрохимический) в трехэлектродной конфигурации, которая состояла из рабочего электрода с золотой мини-сеткой (Buckbee-Mears, Чикаго, Иллинойс), Микроэлектрод сравнения Ag / AgCl / 3M KCl (373 / SSG / 6, Amel electrochemistry, Милан, Италия) и платиновая проволока в качестве противоэлектрода. К ячейке OTTLE прикладывались потенциалы с помощью потенциостата / гальваностата модели 2053 Amel.Постоянная температура поддерживалась циркуляционной водяной баней, а температура ячейки OTTLE контролировалась с помощью микротермопары. УФ-видимые спектры записывали на спектрофотометре Varian Cary C50. Ячейку OTTLE продували газообразным аргоном, чтобы создать в ячейке бескислородную среду. Эксперименты проводили при постоянной температуре 25 ° C, используя 600 мкл образцов, содержащих 15 мкМ белка в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,0), 20 мМ NaCl и 30 мкМ феназинметосульфата. Графики Нернста состояли по крайней мере из пяти точек и неизменно были линейными с наклоном, согласующимся с процессом одноэлектронного восстановления.Вольтамперограммы прямоугольной формы регистрировали с помощью потенциостата / гальваностата мод. 273A (EG&G PAR, Ок-Ридж, США). Графитовый дисковый электрод, платиновая проволока и насыщенный каломельный электрод (SCE) использовались в качестве рабочего, противоэлектрода и электрода сравнения соответственно. Электрический контакт между SCE и рабочим раствором был достигнут с помощью набора Vycor® (PAR). Рабочий электрод очищали перед каждым использованием механической полировкой оксидом алюминия 0,5 мкм с последующим 5 мин в ультразвуковой ванне.Миоглобин наносили на электрод путем капельного литья 10 мкл раствора, содержащего 100 мкМ белка и 20 мМ фосфатный буфер (pH 7,0). Затем электрод инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Следующим этапом было закапывание 20 мкл раствора, содержащего 10% м / м желатина типа A (Sigma-Aldrich, G1890) и 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 2 часов. После этого электрод был готов для электрохимических измерений. Рабочий раствор — 20 мМ фосфатный буфер (pH 7.0). Эксперименты проводились в атмосфере аргона при 25 ° C. Ошибки, связанные со значениями E ° ’, представляют собой стандартные отклонения, рассчитанные по меньшей мере по трем независимым наборам измерений для каждого вида.

Измерение скорости потери гемина для WT и p.His98Tyr

Кинетику диссоциации гемина исследовали следующим образом: мы отслеживали уменьшение со временем (0–350 мин) поглощения при 410 нм для переноса гема из голо WT. (или p. His98Tyr) MB к ​​двойному мутанту апо MB p.His65Tyr / Val69Phe ^20,21 в соотношении концентраций 1:10. Временные ходы были подогнаны к одноэкспоненциальному выражению в GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния), чтобы получить константу скорости диссоциации первого порядка для потери гемина k _-H. Эксперименты проводили при 37 ° C в присутствии 0,45 м сахарозы, в 0,2 м фосфатном буфере при pH 7 или 0,2 м ацетатном буфере, pH 5. УФ-видимые спектры записывали с использованием спектрофотометра Varian Cary C50.

Молекулярное моделирование

Для каждого белка были произведены три МД-моделирования длительностью 350 нс с использованием версии 5.0.4 программного обеспечения GROMACS. Исходная структура миоглобина человека была взята из файла PDB 3RGK ⁵² . Для редактирования файла 3RKG.pdb использовалась программа Modeller ^53,54,55,56 . Структура C-конца была взята из файла PDB 1MWD ⁵⁷ . Структура мутанта p.His98Tyr была получена путем моделирования гомологии с использованием Modeller и использования файла 3RGK в качестве структуры шаблона.Все моделирование проводилось в сокращенном ансамбле. Исходные структуры сначала были расслаблены в вакууме с использованием алгоритма наискорейшего спуска, 3000 шагов, а затем помещены в ромбический додекаэдрический ящик, заполненный молекулами воды TIP3P. Na ⁺ и Cl ^— добавляли для нейтрализации общего заряда белка и для достижения конечной концентрации 100 мМ. Затем системы были расслаблены с помощью алгоритма сопряженных градиентов в два этапа. Затем системы отжигались до 300 К, начиная с 50 К, в течение 100 пс.Затем системы уравновешивали в трех последовательных прогонах, каждый длительностью 500 пс: (i) NVT при 300 K ⁵⁸ , (ii) NPT при 300 K, 1 бар (iii) NPT при 300 K и 1 бар ^{. 59} . Последний каркас использовался в качестве стартовой конструкции для производственного цикла MD в ансамбле NPT при температуре 300 K и давлении 1 бар. Все длины связей были ограничены с использованием алгоритма LINCS ⁶⁰ , и был использован шаг интегрирования 2,0 фс. Электростатика на больших расстояниях была рассчитана методом Эвальда с сеткой частиц ⁶¹ с шагом сетки 0.12 нм в сочетании с кубической интерполяцией четвертого порядка и реальным пространственным ограничением 0,9 нм. Во всех запусках использовалось силовое поле ⁶² CHARMM27 с поправкой CMAP ⁶³ . Три повтора для каждой системы были сделаны с использованием той же начальной структуры, но с изменением начального числа для генератора случайных скоростей. Определение доступной площади поверхности для растворителя (SASA), анализ расстояний, анализ вторичной структуры, Essential Dynamics (ED), расчеты среднеквадратичных флуктуаций и кластерный анализ выполнялись с использованием соответствующих пакетов Gromacs.ED-анализы были выполнены с использованием основных атомов остатков 1–150 как для подгонки, так и для расчета ковариационной матрицы. Процедура кластеризации была выполнена с отсечкой 0,11 нм и методом Громоса ⁶⁴ . Центроиды первых кластеров использовались для сравнения структур. ED-анализ был использован для исследования конформационного пространства, охватываемого WT и мутантным миоглобином p.His98Tyr в рамках моделирования молекулярной динамики (MD), и визуализации основных движений, связанных с каждым видом.Чтобы оценить различия между паттернами флуктуаций, характерными для миоглобина дикого типа и мутанта p.His98Tyr, уравновешенные траектории для двух видов были связаны в единый молекулярно-динамический ансамбль (конкатенированная траектория) и был проведен существенный динамический анализ. Конкатенированная траектория проецировалась на плоскость, определяемую первыми двумя собственными векторами движений, которые обычно называют существенной плоскостью. Это позволило получить двумерное представление конформационного ландшафта, исследованного во время моделирования MD, и для расчета соответствующего ландшафта свободной энергии.

Связывание кислорода с миоглобином человека дикого типа и вариантом His98Tyr

Разрешенное во времени связывание кислорода (O ₂ ) с миоглобином человека дикого типа и варианта His98Tyr контролировали с помощью спектроскопии с остановленным потоком в обычном режиме смешивания . Аппарат с остановленным потоком (модель SX 18MV, Applied Photophysics) был оборудован диодно-матричным детектором и оптической кварцевой ячейкой с длиной пути 10 мм (объем: 20 мкл). Самое быстрое время смешивания составило 0,68 мс. Все измерения проводились при 25 ° C.Для установления исходных условий, свободных от O ₂ , все растворы дегазировали аргоном. Аппарат с остановленным потоком (все шприцы и трубки) тщательно промывали буфером, не содержащим O ₂ (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,0; 20 мМ NaCl). Концентрация МБ дикого типа и варианта в клетке составляла 1 мкм. Перед измерениями дегазированные белковые растворы, не содержащие O ₂ , восстанавливали дитионитом натрия (конечная концентрация 25 мкг / мл ^-1 ). Для проверки связывания кислорода буфер, свободный от O ₂ , промывали O ₂ для различных интервалов времени и определяли концентрацию O ₂ с помощью термостатированного (25 ° C) электрода Кларка (Oxygraph Plus; Hansatech Instruments). , Норфолк, Великобритания).Электрод уравновешивали до 100% насыщения O ₂ путем барботирования O ₂ через буфер и до 0% насыщения путем барботирования с N ₂ до тех пор, пока не были достигнуты соответствующие плато для получения смещения и калибровочного коэффициента. Эксперименты проводились в 20 мМ фосфатном буфере, pH 7,0, с добавлением 20 мМ NaCl. Связывание диоксигена определяли путем отслеживания увеличения поглощения при 418 нм. Кажущиеся константы скорости второго порядка, k _на , были получены из наклона графика значений k _obs (полученных из одноэкспоненциальной аппроксимации соответствующих кривых времени при 418 нм) в зависимости от содержания кислорода. концентрация; k _off был получен из пересечения этого графика.

Оценка клеточного супероксида

Клетки HEK293FT (p15-20) (Invitrogen) высевали на покровное стекло, предварительно покрытое матригелем (Corning), в 12-луночные планшеты для тканевых культур. Клетки трансфицировали плазмидами экспрессии pcDNA3.1, содержащими полноразмерную кДНК человека дикого типа (MB ^WT ) или c.292C> T MB (MB ^p.His98Tyr ), слитую с тегом EGFP (Genscript). Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и Lipofectamine® 3000 (Thermofisher) в соответствии с инструкциями производителя.Эксперименты проводили через 48–72 ч после трансфекции и проводили в трех независимых экспериментах. Плазмиды доступны по запросу. Базальная генерация супероксида оценивалась ⁶⁵ в отдельных клетках, экспрессирующих MB ^WT и MB ^p.His98Tyr (на что указывает положительность EGFP) с использованием флуоресцентного индикатора дигидроэтидиум (DHE, 5 мкм, 515–560 нм вне фильтра, длина 590 нм). пройти em) при 37 ° C. Флуоресцентный сигнал DHE измеряли на цифровой камере Hamamatsu Orca ER, присоединенной к инвертированному микроскопу Nikon TE2000-U.Флуоресцентные изображения получали с интервалом в 1 мин при экспозиции 200 мс. Метаморф 6.3 использовался для количественной оценки сигнала путем ручного отслеживания отдельных клеток. Эквивалентную область, не содержащую клеток, использовали в качестве фона и вычитали. Флуоресценцию DHE для каждой клетки регистрировали как наклон сигнала, измеренного в течение 20 минут, нормализованный к флуоресцентному сигналу, зарегистрированному через 1 минуту.

Тренировка на выносливость способствует десатурации миоглобина во время сокращения скелетных мышц крыс.

Экспериментальные животные и подготовка перфузии задних конечностей.Всех поместили в комнату с регулируемой температурой при 23 ± 2 ° C с 12-часовым циклом свет-темнота и поддерживали на коммерческой диете с водой ad libitum. Процедуры соответствовали «Основным руководящим принципам надлежащего проведения экспериментов на животных и связанной с ними деятельности в академических исследовательских учреждениях» (опубликованных Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии) и были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных. Университета Канадзавы (протокол AP-101636).

Пятинедельных крыс линии Вистар случайным образом делили на группы Con и 4 недели Tr (n = 9 в каждой группе). Протокол обучения плавательной группы был следующим: в первый и второй день крысы плавали по 1 ч в двух 30-минутных схватках с 5-минутным отдыхом. На третьи и четвертые сутки крысы плавали по 1,5 часа тремя 30-минутными схватками, разделенными 5-минутным отдыхом. На пятый день и после него крысы плавали в течение 2 часов за четыре 30-минутных плавания, разделенных 5-минутным отдыхом. За исключением первой тренировки по плаванию до шестого дня, вес, равный 2% от веса тела крыс, был привязан к телам крыс.Крысы выполняли описанный выше протокол плавания шесть дней в неделю. Во время плавания температура воды поддерживалась на уровне 35 ° C. Форма танка была квадратной, его характеристики составляли 48 см в глубину, 80 см в длину и 60 см в ширину. Все крысы плавали в этом резервуаре и имели среднюю площадь поверхности не менее 600 см ² / крысу. Кроме того, мы постоянно следили за тем, чтобы крысы не лазали, не ныряли и не подпрыгивали во время обучения плаванию. В случаях, когда такое поведение наблюдалось, с ним немедленно разбирались.

Через 4 недели (в возрасте 9 недель) перфузия задних конечностей выполнялась в каждой группе (группа Con: исходная масса тела (BW) в возрасте 5 недель; 143–168 г, окончательная BW в возрасте 9 недель; 257– 295 г, группа Tr: начальная масса тела; 140–176 г, конечная масса тела; 226–250 г). Подготовка изолированной задней конечности крысы и перфузионного аппарата описаны в предыдущих отчетах ^4,28 . Все хирургические вмешательства проводились под анестезией пентобарбиталом натрия (45 мг / кг ^-1 внутрибрюшинно). Крыс умерщвляли инъекцией 1 М раствора KCl непосредственно в сердце с последующей хирургической процедурой и добавлением не содержащего гемоглобина буфера Кребса-Хенселейта (NaCl, 118 мМ; KCl, 5.9 мМ; KH ₂ PO ₄ , 1,2 мМ; MgSO ₄ , 1,2 мМ; CaCl ₂ , 1,8 мМ; NaHCO ₃ , 20 мМ; Глюкоза, 15 мМ), уравновешенная 95% O ₂ + 5% CO ₂ при 37 ° C, перфузировали в брюшную аорту в режиме протока при постоянной скорости потока. Чтобы довести перфузионное давление примерно до 80,0 мм рт.ст., скорость потока была установлена ​​на уровне 22,0 ± 0,0 мл мин ^-1 в группе Con и 22,1 ± 0,9 мл мин ^-1 в группе Tr.В этом состоянии среднее перфузионное давление составляло 78,6 ± 7,7 мм рт. Ст. В группе Con и 74,2 ± 5,2 мм рт. Ст. В группе Tr. Следовательно, перфузионное сопротивление не изменялось на протяжении всего периода перфузии. Кроме того, при данной скорости потока не наблюдалось никаких признаков отека задней конечности. Стоки собирали из нижней полой вены для измерения mO ₂ и концентраций лактата и пирувата.

Параметры измерения

Протокол сокращения сокращений и измерение оксигенации Mb и mO ₂ следовали предыдущим методам ^4,28 .Затем обнажали седалищный нерв левой задней конечности и соединяли с двумя параллельными проволочными электродами из нержавеющей стали (Unique Medical, Токио, Япония), а ахиллово сухожилие соединяли с чувствительным тензодатчиком с помощью струны (MLT500 / D, AD Instrument, Касл-Хилл, Новый Южный Уэльс, Австралия). Импульс стимуляции через седалищный нерв, полученный с помощью системы электростимуляции (модель RU-72, Nihon Koden, Токио, Япония), имел частоту 1 Гц (задержка 10 мкс; продолжительность 1 мс) в течение 120 секунд (120 сокращений подергивания).Целевое напряжение контролировали путем изменения напряжения стимулов для получения 50%, 75% и 100% пикового напряжения в условиях перфузии буфера (3-8 вольт). Напряжение подергивания рассчитывалось как среднее значение серии сокращений. Мышца также не показывала признаков усталости даже при самой высокой интенсивности стимуляции.

Прибор NIRS (NIRO-300 + Detection Fiber Adapter Kit, Hamamatsu Photonics, Сидзуока, Япония) использовали для измерения оксигенации Mb в состоянии покоя и во время мышечного сокращения.Расстояние между фотодиодом и светодиодом было фиксированным и составляло 10 мм. Носок стопы фиксировали зажимом, на котором крыса лежала на спине. После этого зонды NIRS прочно прикрепляли к коже икроножной мышцы и фиксировали зажимами с обеих сторон мышцы. В течение начального периода, по крайней мере, за 30 секунд до начала сокращения, средняя флуктуация сигналов NIRS была доведена до контрольного значения, равного нулю. После протокола упражнений аноксический буфер (уравновешенный 95% N ₂ + 5% CO ₂ газа) перфузировали в течение 30 минут для достижения максимальной десатурации Mb.Затем мышца получила электрическую стимуляцию для сокращения в течение 2 минут. Никакого дальнейшего увеличения изменения сигнала NIRS, связанного с концентрацией сигнала деоксигенированного Mb (Δ [дезокси-Mb]), не наблюдалось. Конечная интенсивность сигнала Δ [дезокси-Mb] служила константой нормализации для 100% дезоксигенации Mb.

mO ₂ (мкмоль г ^-1 мин ^-1 ) было рассчитано из артериовенозной разницы содержания O ₂ , умноженной на скорость потока, с использованием двух электродов O ₂ (5300A, YSI, Yellow Springs, Огайо, США).Два электрода O ₂ были отрегулированы на давление пара воды перед экспериментом по перфузии задних конечностей. Стоимость кислорода рассчитывалась путем деления изменения mO ₂ , вызванного сокращением мышц, на напряжение мышц. L / P остается постоянным и не показывает значительного увеличения по сравнению с величиной мышц в состоянии покоя. Уровни лактата могут увеличиваться по ряду причин, включая недостаточное поступление O ₂ . Следовательно, ограниченная доступность кислорода должна приводить к увеличению уровня лактата в начале анаэробного гликолиза.Действительно, L / P увеличивается во время перфузии аноксическим буфером (95% N ₂ ) увеличивается. O ₂ доступность и доставка позволяют выдерживать максимальное сокращение без признаков усталости.

Частота дискретизации данных NIRS составляла 1 Гц. Другие параметры (натяжение, давление перфузии, содержание O ₂ на входе и выходе) были собраны с использованием системы сбора данных (PowerLab 8SP, AD Instruments, Австралия) с частотой дискретизации 1 кГц. Все данные были перенесены на персональный компьютер с программным обеспечением для сбора данных (Chart ver.5.5.6. AD Instruments).

Анализ данных

При анализе данных использовались наши предыдущие методы ⁴ . Простое скользящее среднее сглаживает сигналы Δ [deoxy-Mb] и Δ [oxy-Mb] NIRS с использованием скользящего среднего из 5 пунктов, что соответствует 5-секундному таймфрейму ³⁵ . Сигналы Δ [дезокси-Mb] были откалиброваны по двум различным значениям сигнала NIRS: один в состоянии покоя как деоксигенация 10% Mb, а другой в стационарном состоянии с перфузией аноксического буфера как деоксигенация 100% Mb.В то время как S _mb O ₂ в состоянии покоя не может быть определено NIRS, значение было принято равным 90% на основании предыдущих исследований, сообщающих, что S _mb O ₂ в состоянии покоя было больше 90% ^5,36 .

Графики% Δ [deoxy-Mb] были преобразованы в графики S _mb O ₂ (%) с использованием следующего уравнения:

S _mb O ₂ участков были аппроксимированы следующей одноэкспоненциальной уравнение для расчета параметров кинетики с использованием метода итерационных наименьших квадратов с помощью коммерческого пакета для построения графиков / анализа (KaleidaGraph 3.6.1, Synergy Software, Reading, PA, USA):

, где BL — базовое значение, AP — амплитуда между BL и установившимся значением во время экспоненциальной составляющей, TD — временная задержка между началом сокращения и появлением S _{. mb} O ₂ сигналов и τ постоянная времени S _mb O ₂ кинетика сигнала. MRT, рассчитанный по TD + τ, использовался как эффективный параметр времени отклика для деоксигенации Mb в начале мышечного сокращения. Разделение 63% AP на MRT дает значение для зависящего от времени изменения деоксигенации Mb.Этот параметр, _0,63 AP / MRT, для S _mb O ₂ показывает скорость высвобождения O ₂ из Mb, которая указывает количество O ₂ , высвобождаемое из Mb в единицу времени в начале упражнения. Скорость высвобождения O ₂ из Mb была рассчитана с использованием следующего уравнения:

, где _0,63 AP / MRT для S _mb O ₂ была скоростью деоксигенации Mb в% / сек. Включение этого значения для Mb в уравнение привело к определению скорости высвобождения O ₂ из Mb в микромолях на грамм в минуту.

Мы реконструировали кинетику P _mb O ₂ на основе полученных параметров кинетики S _mb O ₂ . Кинетика модели S _mb O ₂ была преобразована в P _mb O ₂ (мм рт. Для этого уравнения использовался P ₅₀ , равный 2,4 мм рт.ст., при температуре мышц 37 ° C ³⁷ .Вычисленные графики P _mb O ₂ были оценены для получения MRT его кинетики с использованием того же единственного экспоненциального уравнения, что и для P _mb O ₂ . AP / MRT _0,63 для P _mb O ₂ указывает на скорость снижения P _mb O ₂ в начале сокращения мышцы. P _mb O ₂ в установившемся режиме был рассчитан с использованием значения S _mb O ₂ в установившемся режиме. Поскольку парциальное давление O ₂ соответствует определенному количеству растворенного O ₂ , внутриклеточный [O ₂ ] (мкМ) был рассчитан на основе значения P _mb O ₂ в состоянии покоя и при каждой интенсивности упражнений с использованием следующее уравнение:

с P _mb O ₂ в мм рт. ст. и растворимость O ₂ в буфере равна 0.00135 мкмоль мл ⁻¹ мм рт. Ст. ⁻¹ при 37 ° C ³⁸ .

Концентрация

Mb и активность CS в перфузированной буфером мышечной ткани

После эксперимента по перфузии буфера концентрацию Mb в мышечной ткани измеряли модифицированным методом Рейнафарье ³⁹ . Активность CS, митохондриального фермента и маркера окислительного потенциала мышц, измеряли в гомогенатах цельных мышц с использованием спектрофотометрического метода Srere ⁴⁰ .

Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение.Статистические различия были исследованы с использованием двухфакторного непарного дисперсионного анализа (ANOVA) (уровень напряжения × тренировка). Применяли апостериорный тест Турции-Крамера, если ANOVA указывал на значительную разницу. Непарный t -тест использовался для сравнения биохимических и физиологических параметров между группами. Коэффициент корреляции Пирсона был рассчитан при оценке взаимосвязи между двумя переменными. Уровень значимости был установлен на уровне p <0,05.

Пара человеческих антител к миоглобину — без БСА и азида (ab241808)

Обзор

• Название продукта

• Тип анализа

  Набор для ELISA

• Диапазон

  7,8 пг / мл — 500 пг / мл

• Реактивность видов

  Реагирует с: Человек, Cynomolgus, обезьяна-резус
  

• Обзор продукции

  Пара антител может использоваться для количественного определения миоглобина человека.Пары свободных антител от BSA и азида включают неконъюгированные захватывающие и детекторные антитела, подходящие для сэндвич-ELISA. Приблизительная концентрация антител составляет 1 мг / мл, измеренная методом протеина А280. Рекомендуемая ориентация антител основана на внутренней оптимизации анализов на основе ELISA. Ориентация антител зависит от анализа и должна быть оптимизирована для каждого типа анализа. И улавливающие, и детекторные антитела представляют собой кроличьи моноклональные антитела, дающие согласованные, специфические и чувствительные результаты.

  Для получения дополнительной информации о характеристиках пары антител см. Эквивалентный набор SimpleStep ELISA® (ab171580), в котором используются те же антитела. Однако из-за различий в их составе эту пару антител нельзя использовать с расходными материалами, поставляемыми с нашими наборами SimpleStep ELISA. Обратите внимание, что диапазон, указанный для пар, является только оценкой, основанной на эффективности родственного продукта с использованием той же пары антител. Эффективность пары антител будет зависеть от конкретных характеристик вашего анализа.Мы гарантируем, что продукт работает в сэндвич-ИФА, но мы не гарантируем чувствительность или динамический диапазон пары антител в вашем анализе.

  Загрузите SDS здесь.

• Протестированные приложения

• Платформа

  Реагенты

Недвижимость

• Инструкции по хранению

  Хранить при + 4 ° C.См. Протоколы.

• Без перевозчика

  Есть

• Компоненты	10 x 96 тестов
  Человеческое антитело, захватывающее миоглобин (неконъюгированное)	1 x 100 мкг
  Антитела детектора миоглобина человека (неконъюгированные)	1 x 100 мкг

• Направления исследований

• Функция

  Служит резервным источником кислорода и способствует перемещению кислорода в мышцах.

• Сходства последовательностей

  Принадлежит к семейству глобинов.

• Информация от UniProt

• Альтернативные названия

  • МБ
  • MGC13548
  • MYG_HUMAN
  • Миоглобин

• Ссылки на базы данных

Приложения

Гарантия Abpromise

Наша гарантия Abpromise распространяется на использование ab241808 в следующих протестированных приложениях.

Примечания по применению включают рекомендуемые начальные разведения; Оптимальные разведения / концентрации должны определяться конечным пользователем.

Заявка	Отзывы	Банкноты
Сэндвич ELISA		Использование при концентрации, зависящей от анализа.

Примечания
Сэндвич-ELISA Использование при концентрации, зависящей от анализа.

Изображения

• Сэндвич-ELISA — пара антител к миоглобину человека — без БСА и азида (ab241808)

  Чтобы узнать больше о преимуществах рекомбинантных антител, см. Здесь.

• Репрезентативная стандартная кривая миоглобина человека с использованием метода сэндвич-ELISA

  Типичная стандартная кривая из соответствующего набора SimpleStep ELISA® (ab171580), в котором используется та же пара антител.Дополнительную информацию о характеристиках пары и комплекта см. В соответствующем техническом описании комплекта. Из-за различий в составе и формате антител в этой паре их нельзя использовать в качестве заменителей компонентов антител в наших наборах SimpleStep ELISA®.

Протоколы

Насколько нам известно, для этого продукта не требуются индивидуальные протоколы. Пожалуйста, попробуйте стандартные протоколы, перечисленные ниже, и сообщите нам, как у вас дела.

Щелкните здесь, чтобы просмотреть общие протоколы

Список литературы (0)

ab241808 еще не упоминался в каких-либо публикациях.

Отзывы клиентов, вопросы и ответы

.