Флуоресцентная гибридизация in situ — Википедия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Флуоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization — FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике^[1], в диагностике онкологических заболеваний^[2], в ретроспективной биологической дозиметрии^[3].

При флуоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин^[en] (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флуоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стрептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3—4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала

[4].

Для создания ДНК-зондов используют клонированные последовательности ДНК (например, NoiI-связующие клоны 3-й хромосомы человека, БАК^[en]-клоны)^[5][6], геномную ДНК, продукты ПЦР, меченые олигонуклеотиды, а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции^[4].

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путём ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Схема эксперимента по флуоресцентной гибридизации in situ для локализации положения гена в ядре

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например,

Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.

Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.

RGEN-ISL Метод молекулярной визуализации с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/dCas9 связанной с меткой. В отличие от классической флуоресцентной гибридизации in situ, RGEN-ISL не требует денатурации ДНК и, следовательно, обеспечивает лучшую сохранность структуры хроматина.

1. ↑ Шилова Н. В., Золотухина Т. В. Интерфазная флуоресцентная гибридизация in situ в диагностике числовых хромосомных аберраций// Медицинская генетика. — 2007. — Т. 6. — № 10. — С. 53—58.
2. ↑ Bridge J. A., Cushman-Vokoun A. M.. Molecular diagnostics of soft tissue tumors (неопр.) // Archives of Pathology & Laboratory Medicine. — 2011. — May (т. 135, № 5). — С. 588—601. — DOI:10.1043/2010-0594-RAIR.1. — PMID 21526957.
3. ↑ Ainsbury E. A., Bakhanova E., Barquinero J. F. et al. Review of retrospective dosimetry techniques for external ionising radiation exposures (англ.) // Radiation Protection Dosimetry : journal. — 2011. — November (vol. 147, no. 4). — P. 573—592. — DOI:10.1093/rpd/ncq499. — PMID 21183550.
4. ↑ ^{1 2} Рубцов Н. Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие. — Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т, 2006. — 152 с. — ISBN 5-94356-376-8.
5. ↑ Sazanov A. A., Sazanova A. L., Stekol’nikova V. A., Kozyreva A. A., Romanov M. N., Malewski T., Smirnov A. F. Chromosomal localization of seven HSA3q13→q23 NotI linking clones on chicken microchromosomes: orthology of GGA14 and GGA15 to a gene-rich region of HSA3 (англ.) // Cytogenetic and Genome Research (англ.)русск. : журнал. — Basel, Switzerland: Karger Publishers, 2005. — Vol. 111, no. 2. — P. 128—133. — ISSN 1424-8581. — DOI:10.1159/000086381. — PMID 16103653. Архивировано 15 марта 2015 года.
    (Проверено 15 марта 2015)
6. ↑ Sazanov A. A., Romanov M. N., Sazanova A. L., Korczak M., Stekol’nikova V. A., Kozyreva A. A., Smirnov A. F., Jaszczak K., Dodgson J. B. Chromosomal localization of 15 large insert BAC clones containing three microsatellites on chicken chromosome 4 (GGA4) which refine its centromere position (англ.) // Animal Genetics : журнал. — Oxford, UK: International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd, 2005. — Vol. 36, no. 2. — P. 161—163. — ISSN 0268-9146. — DOI:10.1111/j.1365-2052.2004.01225.x. — PMID 15771730. Архивировано 15 марта 2015 года. (Проверено 15 марта 2015)

• Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий // Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний. Введение в молекулярную диагностику / Под ред. М. А. Пальцева, Д. В. Залетаева. — М.: Медицина, 2011. — Т. 2. — С. 100—136. — 1000 экз. — ISBN 978-5-225-03557-0.

Анализ FISH при раке молочной железы

Рак молочной железы является самым частым онкологическим заболеванием у женщин. Поэтому данной проблеме уделяется очень много внимания со стороны врачей и ученых. На сегодняшний день методы диагностики рака молочной железы существенно изменились и усовершенствовались. Одним из таких методов является флуоресцентная гибридизация in situ или FISH (фиш).

Зачем нужен FISH-анализ?

Рак молочной железы может иметь различный гормональный статус, который очень важно определить для подбора дальнейшего лечения. Выделяют несколько биологических маркеров опухоли, одним из которых является рецептор HER2-neu. Он отвечает за рост и деление клеток.

Примерно в 25-30% случаев рака молочной железы отмечается увеличение экспрессии данного гена, который кодирует одноименный белок HER2-neu. В связи с этим, клетки начинают бесконтрольно делиться, а сама опухоль становится агрессивной и характеризуется неблагоприятным прогнозом. Зная эту особенность, ученые смогли разработать специальный лекарственный препарат. Это моноклональное антитело, которое позволяет «заблокировать» белок HER2-neu и снизить агрессивность рака молочной железы. Однако для того, чтобы этот препарат оказался эффективным, необходимо точно определить, что у конкретного пациента имеется повышенная экспрессия белка HER2-neu в опухолевой ткани. Эту задачу как раз и призван решить фиш тест.

Когда назначается FISH тест

Определить статус HER2-neu в клетках рака молочной железы можно разными способами. Наиболее простым и дешевым является иммуногистохимическое исследование. Однако в части случаев оно не дает точного ответа. При анализе результатов, врач определяет статус HER2-neu в баллах или плюсах (+).

• 0-1+ — результат негативный.
• 2+ — статус не определен.
• 3+ — статус позитивный.

FISH тест назначается при неопределенном результате иммуногистохимического исследования (2+). В этом случае нельзя достоверно оценить экспрессию гена, следовательно, нельзя быть уверенным, что пациенту поможет соответствующее лечение.

На сегодняшний день не существует FISH-тестов, позволяющих проводить раннюю диагностику рака молочной железы. Это исследование показано тем женщинам, у которых уже опухоль выявлена, удалена и которым требуется подобрать лечение.

Подготовка к тесту и алгоритм его проведения

Для того чтобы провести FISH исследование, необходимо получить образец опухолевых клеток. Как правило, к тому моменту, когда женщине назначается данный анализ, она уже прошла все необходимые диагностические процедуры, в том числе биопсию. Однако в некоторых случаях требуется повторное проведение биопсии молочной железы, о чем врач предупредит заранее.

На следующем этапе обязательно проводится иммуногистохимическое исследование. Во-первых, оно более дешевое и простое, во-вторых, оно тоже с большой точностью может помочь определить статус HER2-neu в молочной железе. Если результат иммуногистохимии оценивается в 2+, то материал отправляется на FISH исследование.

Тест проводится на таком же материале молочной железы, который использовался при проведении иммуногистохимии. Метод FISH подразумевает использование ДНК-зондов, которые связываются с определенными мишенями в клетке. Для того чтобы зонд можно было визуализировать, его помечают специальными флуоресцентными красителями.

При оценке статуса HER2-neu интерес представляет 17 хромосома, на которой расположен ген, который кодирует данный белок. В процессе проведения FISH теста можно оценивать как количество хромосом, так и количество копий гена в клетках рака молочной железы. Для этого ткань проходит пробоподготовку и помечается ДНК-зондом, после чего врач оценивает срез под флуоресцентным микроскопом и дает свое заключение.

Достоинства и недостатки FISH теста

В настоящее время метод FISH позволяет с высокой точностью определить HER2-статус опухоли молочной железы и подобрать необходимое лечение. Такая необходимость возникла с разработкой лекарственного препарата Трастузумаб (Герцептин). Согласно исследованиям, при назначении его на ранних стадиях рака молочной железы удается снизить вероятность рецидива заболевания на 50%, а показатели смертности — на 30%, что является очень хорошим результатом.

Препарат оказывает действие только на те клетки рака молочной железы, которые отличаются высокой гиперэкспрессией HER2-neu. В остальных случаях Герцептин будет неэффективен. Среди других достоинств, которыми обладает тест FISH, можно отметить относительно быстрые сроки выполнения анализа (около 2-3 дней), высокую чувствительность и специфичность.

Для проведения FISH теста требуется дорогостоящее оборудование (флуоресцентный микроскоп) и расходные материалы, поэтому его пока предлагают лишь крупные клиники и диагностические центры. Кроме того, стоимость самого исследования также является высокой, но при этом полностью оправдывает себя.

Тест FISH — это один из методов современной диагностики рака молочной железы, который применяется только в специфических ситуациях. Несмотря на высокую точность, его не требуется назначать всем пациентам подряд, но при наличии показаний, этот метод может существенно помочь в выборе метода лечения и улучшить прогноз при раке молочной железы.

Запись на консультацию круглосуточно

FISH-диагностика: быстрый ответ на главный вопрос

Инвазивные методы пренатальной диагностики позволяют не только заглянуть в будущее и достоверно предсказать ожидают ли еще неродившегося малыша заболевания, связанные с внутриутробными пороками развития, но и выяснить характер и причины врожденных патологий.

Однако любая информация имеет ценность лишь тогда, когда является своевременной. Если речь идет о состоянии развития плода, скорость получения результатов анализов приобретает жизненно-важное значение.

Поэтому, FISH-метод, позволяющий оценить наличие у эмбриона наиболее часто встречающихся аномалий развития в максимально короткие сроки, весьма востребован в генетической диагностике.

Что такое «FISH-метод»?

FISH– аббревиатура, в расшифровке которой кроется суть технологии выявления хромосомных аномалий – fluorescence in situ hybridization – флюоресцентной гибридизации в «домашней» среде.

Этот прием, предложенный в конце 70-х годов прошлого века Дж. Голлом и М.-Л. Пардью, основан на возможности восстановления последовательности расположения фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) после их денатурации.

Авторы разработали метод, позволяющий с помощью гибридизации in situ искусственно созданных меченых ДНК-проб (зондов) и цитогенетического материала, взятого на анализ, выявить количественные и качественные отклонения интересующих хромосом.

В конце прошлого века, после успешного применения для окрашивания ДНК-зондов флуоресцентных красителей, FISH-метод получил свое название и с тех пор интенсивно совершенствуется и вариатизируется.

Современные методики FISH-анализа стремятся к тому, чтобы обеспечить возможность получения максимально полной информации для анализа забранного генетического материала за одну процедуру гибридизации.

Дело в том, что единожды после гибридизации можно оценить лишь ограниченное количество хромосом одного и того же цитогенетического материала. Способность же к повторной гибридизации ДНК-цепочек снижается от раза к разу.

Поэтому, на данный момент в генетической диагностике наиболее часто метод гибридизации in situ применяется для быстрого ответа на вопросы об имеющихся, наиболее распространенных анеуплоидий по 21, 13, 18 хромосомах, а также по половым хромосомам X, Y.

Для проведения анализа FISH-методом подходят любые тканевые или клеточные образцы. 

В пренатальной диагностике, это могут быть образцы крови, эякулята, фрагменты хориона, амниотическая жидкость или пуповинная кровь плода.

Быстрота получения результатов обеспечивается тем, что клетки, полученные из забранного на анализ материала, не нужно культивировать в питательных средах, добиваясь их деления до нужного количества, как при классическом способе кариотипирования.

Отобранный материал проходит специальную подготовку для получения концентрированной чистой клеточной суспензии. Далее проводят процесс денатурации ДНК-пробы и нативных ДНК исследуемого образца до одноцепочечного состояния и процесс гибридизации, во время которого окрашенные ДНК-зонды инкубируются с ДНК образца.

Таким образом, визуализируются искомые (окрашенные) хромосомы в клетке, оценивается их количество, строение генетических структур и т.п. Рассмотреть светящиеся цепочки ДНК позволяет окуляр особого флуоресцентного микроскопа.

В настоящее время FISH-метод широко используется в диагностических целях для выявления генетических заболеваний, хромосомных аберраций в репродуктивной медицине, онкологии, гематологии, в биологической дозиметрии и т.п.

Как применяют FISH-диагностику плода?

В сфере репродуктивной медицины FISH-метод, как один из приемов молекулярной цитогенетической диагностики, используется на всех этапах.

Для определения кариотипа будущих родителей – проводится единожды, так как геном человека неизменен в течение всей жизни.

Кариотипирование пары перед зачатием ребенка поможет выявить являются ли родители носителями генетических патологий, передающихся по наследству, в том числе скрытых. А также общее состояние генома будущих мамы и папы, которое может повлиять на успешность зачатия малыша и вынашивания беременности.

Диагностика FISH-методом в данном случае зачастую выступает как дополнительное обследование к классическому кариотипированию, при выявлении хромосомных патологий в исследуемом материале (венозной крови родителей), если есть подозрение на мозаицизм.

Дообследование FISH-методом позволит достоверно подтвердить или опровергнуть наличие подозреваемой аномалии в клетках будущего родителя.

• Исследование эякулята.

Показано при трудностях с репродукцией в паре по «мужскому фактору». Анализ спермы FISH-методом позволит оценить уровень аномальных по хромосомному набору сперматозоидов, а также определить является ли мужчина носителем генетических заболеваний, сцепленных с полом.

Если пара в дальнейшем прибегнет к зачатию с помощью ЭКО, FISH-анализ эякулята позволит отобрать наиболее качественные сперматозоиды для оплодотворения яйцеклетки.

Для предимплантационной генетической диагностики (ПГД). По результатам исследований кариотипа родителей определяются возможные хромосомные, генетические абберации, которые могут быть переданы эмбриону.

Благодаря возможностям FISH-диагностики, исследование генетического здоровья образовавшихся эмбрионов можно осуществить в считанные часы до переноса в полость матки, чтобы обеспечить наступление беременности заведомо здоровым плодом.

Кроме того, возможности ПГД позволяют определить половую принадлежность эмбрионов, а, следовательно, «заказать» пол будущего ребенка, если это необходимо.

• В период вынашивания беременности.

В пренатальной диагностике: анализ плодовых клеток, полученных с помощью биопсии ворсин хориона, амниоцентеза или кордоцентеза, методом FISH медицинские центры обычно предлагают в дополнение к классическому генетическому исследованию клеток плода (кариотипированию).

Этот метод незаменим, когда необходимо быстрое получение ответа о наличии у плода наиболее распространенных хромосомных пороков: трисомии по 21, 18, 13 хромосомах, аббераций в хромосомах X и Y, иногда также анеуплоидий по 14 (или 17),15, 16 хромосомам.

Достоинства анализа FISH-методом

Проведение генетического анализа FISH-методом, хоть и остается на сегодняшний день вспомогательным методом диагностики хромосомных патологий, однако целесообразность его проведения обуславливают неоспоримые преимущества:

• скорость получения результатов, касающиеся тестируемых хромосом – в течение нескольких часов – не более 72-х.

Это может быть важно, если от диагноза генетиков зависит судьба беременности;

• высокая чувствительность и достоверность метода FISH–успешное проведение анализа возможно на ничтожно малом количестве биоматериала – достаточно одной клетки, погрешность результатов при этом, не более 0,5%.

Это может быть важно при ограниченном количестве клеток в исходном образце, например, при плохом их делении.

• возможность проведения диагностики FISH-методом на любом сроке беременности (с 7-ой недели) и по любому биологическому образцу: фрагменты хориона, амниотическая жидкость, плодная кровь и т.п.

Где можно сделать диагностику FISH-методом

В Москве FISH-метод для пренатальной диагностики хромосомных отклонений плода применяют в следующих медицинских центрах:

Наименование медицинского учреждения	Стоимость процедуры, руб
Клиника «Мать и Дитя» Савеловская (ранее «Клиника Здоровья»)	10 000 (амниоцентез с FISH-анализом)
Лаборатория «Геномед»	8 000 (за одну пару хромосом)
ФГБНУ “Медико-Генетический Научный Центр”	11 000 (за две пары хромосом)

Как правило, клиники предлагают услугу FISH-диагностики в рамках полного кариотипирования плода путем инвазивного вмешательства за дополнительную плату. И, как правило, будущие родители согласны доплатить, ведь благодаря FISH-методу уже через пару суток можно узнать о своем малыше самое главное

ВКонтакте

Facebook

Добавить комментарий

FISH-диагностика (хромосомы X и Y)

Исследование половых хромосом высокочувствительным молекулярно-цитогенетическим FISH(fluorescence in situ hybridization)-методом позволяет выявить даже небольшие изменения как в хромосоме, так и в ее части (подтвердить наличие хромосомной перестройки, уточнить точки разрыва хромосом и др.).

Синонимы русские

FISH-тест на генетические аномалии половых хромосом, FISH-диагностика плода, FISH-диагностика синдрома Клайнфелтера, FISH-диагностика синдрома Тернера, FISH-диагностика синдрома Мартина — Белл (синдром ломкой X-хромосомы), предимплантационная генетическая диагностика (ПГД), FISH-диагностика заболеваний, сцепленных с полом.

Синонимы английские

FISH analysis on Fragile X Syndrome, FISH diagnosis of 47, XYY Syndrome, FISH-test for genetic abnormalities, FISH analysis of sex chromosomes (X and Y), FISH testing Turner’s Syndrome, FISH diagnosis of Klinefelter’s Syndrome, fetal sex test, preimplantation genetic diagnosis (PGD), FISH diagnosis of Sex-Linked Genetic Diseases.

Метод исследования

Дифференциальное окрашивание хромосом.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Исследование проводится в состоянии сытости, не рекомендуется сдавать кровь на данное исследование натощак.
• Исключить (по согласованию с врачом) прием антибактериальных и химиотерапевтических препаратов в течение 14 дней до исследования.
• Исследование рекомендуется проводить не ранее чем через 2 недели после перенесенных инфекционных/острых воспалительных заболеваний.

Общая информация об исследовании

Цитогенетический анализ проводится методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH, от англ. fluorescence in-situ hybridization). Подробнее с методом можно ознакомиться здесь (https://helix.ru/kb/item/12-052).

У человека 46 хромосом (23 пары), из них две половые — XX или XY. В норме у женщины имеется 2 X хромосомы, такой кариотип обозначается как 46XX, у мужчины есть одна X и одна Y хромосома (кариотип 46XY). Возможны различные варианты количественных и качественных генетических аномалий половых хромосом. Например, приблизительно у 1 из 350 новорождённых мальчиков кариотип 47,XXY или 47,XYY, а у одного ребенка на каждые несколько тысяч новорождённых — моносомия по Х-хромосоме.

Аномалии половых хромосом являются общими и вызывают синдромы, связанные с рядом физических и психических нарушений. Многие из этих заболеваний не определяются внутриутробно, если беременной не проводится пренатальное тестирование по другим причинам, например из-за ее более старшего возраста. Часто отклонения трудно распознать при рождении и они диагностируются только в период пубертата. 

Синдромы, вызванные аномалиями половой хромосомы, менее выражены, чем при патологии аутосомных хромосом. Например, девочки, у которых есть дополнительная Х, часто кажутся нормальными физически и умственно, затем, вырастая, являются плодовитыми. Напротив, у детей с лишними аутосомными хромосомами (от 1 до 22) обычно наблюдаются серьезные нарушения, такие как синдром Дауна, который обычно возникает при трисомии хромосомы 21 (три вместо пары). А дополнительная хромосома 1 может быть фатальной для плода. Девочки без половой хромосомы жизнеспособны, тогда как плоды, у которых отсутствует аутосомная хромосома, не выживают. Часто сниженная фертильность или бесплодие связаны с патологией в половой хромосоме. Так, при первичной аменорее аберрации Х-хромосомы находят примерно у 25% женщин. В связи с этим многим бесплодным парам рекомендуется пройти генетическое исследование.

В настоящее время существует более 300 наследственных заболеваний, передающихся сцепленно с полом (например, Болезнь Фабри, гемофилия А и В, прогрессирующие мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера, X-сцепленная глухота). Для данной патологии обычно характерно, что здоровые женщины-носительницы передают патологический ген своим сыновьям. При рождении мальчиков вероятность их поражения составляет 50%, в то время как девочки рождаются фенотипически здоровыми, но 50% из них являются носителями. Если женщина знает, что она является носительницей наследственного заболевания, сцепленного с полом, то рекомендуется пройти генетическое обследование на ранних сроках беременности, чтобы решить вопрос о необходимости ее прерывания.

Синдром Тернера (в РФ более известный как синдром Шерешевского — Тернера) встречается примерно у 1/2500-3000 живых женских родов во всем мире. 99% из 45,X0 вариантов прерываются спонтанно. Около 50% пораженных девочек имеют 45,X0 кариотип, около 80% из них потеряли отцовскую X. Большинство других из 50% — это мозаики (например, 45,X0/46,XX или 45,X0/47,XXX). Около 15-20% из половины случаев связаны со структурными перестройками Х-хромосомы, например делецией короткого или длинного плеча, изохромосомой Х по длинному или короткому плечу, кольцевой Х-хромосомой. Среди мозаичных девочек фенотип может отличаться от типичного для этой патологии.

Беременность плодом, имеющим синдром Тернера, часто протекает неблагоприятно, с угрозой выкидыша и преждевременных родов. И как правило, риск возникновения этой генетической поломки никак не связан с возрастом беременной. У младенцев высокий риск развития дисплазии бедра, а 10% подростков имеют сколиоз. Остеопороз и переломы довольно часто отмечаются среди женщин с этим синдромом. Часто новорождённые с синдромом Тернера практически не отличаются от здоровых детей. но у многих из них даже при доношенном сроке беременности наблюдается сниженная масса тела и небольшой рост. Некоторые из них имеют выраженную отечность рук и ног, лимфостаз и/или короткую шею со свободными складками кожи по бокам (птеригиум-синдром). В раннем возрасте часто наблюдается слабый сосательный рефлекс, моторное беспокойство, срыгивания фонтаном, отставание в физическом развитии. Умственная отсталость встречается редко, но у многих детей есть проблемы с обучением из-за дефицита внимания и/или гиперактивности. При классическом типе заболевание проявляется коарктацией аорты и различными врождёнными пороками сердца. Артериальная гипертензия часто возникает в старшем возрасте, даже без коарктации. Также характерны аномалии почек (например, подковообразная) и гемангиомы. У большинства пациентов наблюдаются потеря слуха, косоглазие, дальнозоркость или близорукость, дальтонизм. Дисгенезия гонад (вместо яичников лентовидные полоски белесоватой ткани без ооцитов) характерна для 90% женщин. Тиреоидит, гипотиреоз, сахарный диабет, алопеция, ожирение, гипертрихоз и целиакия более распространены, чем среди населения в целом. Взрослые обычно низкорослые, с короткой шеей с крыловидными складками, широкой грудной клеткой, низкой границей роста волос, с недоразвитой нижней челюстью, высоким нёбом, аномалиями прикуса, деформацией ушных раковин. Также обращают на себя внимание множественные пигментированные невусы, девиация локтевых суставов, укорочение IV и V пальцев на руках и ногах и гипоплазия ногтей. Дисгенезия гонад приводит к невозможности нормального полового созревания и к соответствующим клиническим симптомам (например, отсутствие менструации, недоразвитие первичных половых признаков). В подавляющем большинстве случаев женщины бесплодны, но при мозаичных вариантах возможно зачатие и вынашивание плода. 

Крайне редко синдром Тернера встречается у мужчин (известно чуть более 70 случаев) и связан в таком случае с транслокацией или хромосомным мозаицизмом.

Синдром Мартина — Белл (синдром ломкой X-хромосомы, fragile X syndrome) является наиболее часто диагностируемой наследственной причиной умеренной умственной недостаточности. При этом чаще страдают мальчики, чем девочки. Симптомы синдрома Мартина — Белл вызваны аномалией гена FMR1 в локусе Хq27.3, приводящей к недостаточной выработке белка FMR1, необходимого для нормального развития нервной системы. Эта патология встречается приблизительно у одного из 2000-3000 мужчин и у одной из 259 женщин. Дети и взрослые могут иметь физические, интеллектуальные и поведенческие проблемы. Новорождённые крупные с большой головой, с широким и высоким лбом, с большими (часто оттопыренными) ушами, вытянутым лицом и выступающим подбородком. Многие из них светловолосые с голубыми глазами. У мальчиков большие яички, что становится наиболее очевидным после полового созревания. Часто наблюдаются аномально гибкие подвижные суставы, возможно развитие сердечной недостаточности из-за пролапса митрального клапана. Могут быть не все признаки, а один или несколько. У всех детей наблюдается олигофрения разной степени выраженности, сопровождающаяся различной неврологической симптоматикой. Могут развиться проявления, напоминающие аутизм (например, непереносимость прикосновений, плохой зрительный контакт, эхолалия). Такие больные часто говорят быстро, сбивчиво, может быть «бормочущая речь», разнообразные гримасы, монотонное хныканье и дискоординация движений.

Синдром FXTAS (тремор/атаксия, ассоциированные с ломкой Х-хромосомой) может поражать до 1 из 3000 мужчин старше 50 лет. Он является результатом менее обширной аномалии (называемой премутацией) в гене FMR1. Риск развития расстройства возрастает по мере старения. Часто заболевание начинается с тремора рук во время выполнения какого-то движения. Затем появляются проблемы с координацией (медленно прогрессирует атаксия), паркинсонизм и в конечном итоге деменция. На поздних стадиях может утрачиваться контроль над функциями тазовых органов. После появления симптомов люди могут прожить от пяти до двадцати пяти лет.

При синдроме тройного Х (Triple X) дополнительная Х-хромосома обычно унаследована от матери. Чем старше мать, тем больше риск развития у плода этого синдрома. Примерно 1 из каждых 1000 девочек рождается с третьей Х-хромосомой. Синдром Triple X редко вызывает очевидные физические нарушения. Девочки могут иметь более низкий уровень интеллекта, проблемы с вербальными навыками и больше проблем с обучением, чем их братья и сестры. Иногда синдром вызывает нарушения менструального цикла и бесплодие. Тем не менее некоторые женщины с синдромом тройного Х родили физически нормальных детей с нормальным кариотипом. По данным некоторых исследований, около 90% трисомиков по X-хромосоме остаются невыявленными.

В чрезвычайно редких случаях рождаются младенцы с четырьмя или даже пятью Х-хромосомами. Чем больше Х-хромосом, тем больше вероятность умственной отсталости и физических аномалий.

Синдром 47, XYY встречается примерно у 1/1000 мальчиков. Дети, как правило, выше среднего и имеют небольшое снижение IQ по сравнению с членами семьи. Наличие второй Y-хромосомы в большинстве случаев не ведёт к каким-либо физическим отклонениям. В младшем возрасте могут быть расстройства поведения, гиперактивность, нарушение внимания и расстройства обучения. Взрослые мужчины часто импульсивны, эмоционально незрелы, могут казаться неуклюжими.

Синдром Клайнфелтера — наиболее распространенное расстройство половой хромосомы, встречающееся примерно у 1 из 500 новорождённых мальчиков. Чаще всего он возникает из-за наличия дополнительной копии Х-хромосомы в каждой клетке (47, XXY). В 60% случаев дополнительная Х-хромосома — материнская. Часто это препятствует нормальному функционированию яичек и приводит к снижению уровня андрогенов. Мужчины с этим синдромом, как правило, высокие с непропорционально длинными руками и ногами. У 70% из них развивается гинекомастия (увеличение грудных желез). Половое созревание обычно происходит в срок или с небольшой задержкой, но часто плохо растут усы и борода. Дети с синдромом Клайнфелтера часто имеют трудности с обучением и задержку развития речи. Они могут быть как спокойны, чувствительны и ненавязчивы, так и, наоборот, агрессивными, склонными к асоциальному поведению. По сравнению со здоровыми мужчинами у взрослых с этим синдромом имеется повышенный риск развития рака молочной железы, системной красной волчанкой и легочных заболеваний. Развитие яичек варьируется от полностью нефункциональных канальцев до некоторого производства сперматозоидов; часто повышается экскреция фолликулостимулирующего гормона с мочой. Примерно в 15% случаев наблюдается мозаицизм, который сопровождается менее выраженной клиникой, дает лучший прогноз в отношении фертильности и психосоциальной адаптации. Встречаются мужчины с синдромом Клайнфелтера, у которых есть 3, 4 и даже 5 Х хромосом. По мере увеличения количества хромосом X возрастает также выраженность умственной отсталости и пороков развития. Каждый дополнительный X связан с сокращением IQ на 15-16 единиц, с речевыми нарушениями. Диагноз «синдром Клайнфелтера» подозревается при физическом осмотре подростка с маленькими яичками и гинекомастией. У многих мужчин он диагностируется во время оценки бесплодия (вероятно, все немозаичные 47, XXY мужчины бесплодны).

Для чего используется исследование?

• Для диагностики генетических нарушений половых хромосом.

Когда назначается исследование?

• При бесплодии.
• При привычном невынашивании плода.
• При измененном кариотипе абортивного материала.
• При множественных неудачных попытках ЭКО.
• При предимплантационной генетической диагностике (ПГД) в рамках ЭКО.
• Если во время классического кариотипирования возникли подозрения, требующие уточнения.
• Пренатальная диагностика при подозрении на наличие отклонений в развитии плода (например, отклонения от нормы во время УЗИ).
• При возможном влиянии мутагенных факторов во время беременности.
• Постнатальная диагностика генетической патологии у ребенка при наличии соответствующих клинических признаков.
• При планировании последующих беременностей, если в семье есть ребенок с хромосомной аномалией.

Что означают результаты?

В норме двадцать третья пара хромосом (половая) — это XY у мужчины и ХХ у женщины.

При исследовании эякулята в каждом сперматозоиде должен быть один сигнал половой хромосомы (либо X, либо Y).

В настоящее время 56% морфологически нормальных эмбрионов женщин после 35 имеют хромосомные аномалии.

Что может влиять на результат?

Во время пренатальной диагностики есть риск «засорения» образца материнскими клетками, что может повлиять на результат исследования.

 Скачать пример результата

Важные замечания

• FISH-тест часто используется совместно с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Важно не забывать о таком явлении, как мозаицизм — сочетание в тканях индивидуума двух и более популяций клеток с разным генотипом. Причем клетки с аномальным и нормальным кариотипом могут наличествовать как во всех тканях организма (генерализованная форма), так и в отдельных тканях (ограниченная форма).
• Исследование можно проводить начиная с 10-12-й недели беременности.
• Высокая информативность и точность (99,9%) метода позволяет выявлять патологию на уровне фрагментов хромосом, что важно для постановки правильного диагноза, выработки дальнейшей тактики ведения беременной и прогноза для ребенка.

Также рекомендуется

[40-006] Беременность — Пренатальный скрининг трисомий I триместра беременности (синдром Дауна)

[16-001] Исследование кариотипа

[40-007] Беременность — Пренатальный скрининг трисомий II триместра беременности

[16-011] Диагностика микроделеционных синдромов Прадера – Вилли, Ангельмана, Ди Джорджи методом FISH (1 конкретный синдром)

Кто назначает исследование?

Педиатр, врач-генетик, эндокринолог, невролог, репруктолог.

Литература

• Lynn B. Jorde,John C. Carey,Michael J. Bamshad. Medical Genetics. 4th edition. Philadelphia : Mosby/Elsevier, c2010.
• Tartaglia NR, Howell S, Sutherland A, Wilson R, Wilson L (2010). «A review of trisomy X (47,XXX)». Orphanet J Rare Dis 5: 8. DOI:10.1186/1750-1172-5-8.
• Maureen A. Leehey. Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS): Clinical Phenotype, Diagnosis and Treatment. J Investig Med. 2009 Dec; 57(8): 830–836. doi: 10.231/JIM.0b013e3181af59c4.
• Visootsak J, Aylstock M, Graham JM Jr. Klinefelter syndrome and its variants: an update and review for the primary pediatrician. Clin Pediatr (Phila). 2001 Dec;40(12):639-51.
• The Turner Syndrome Society of the United States: 1-800-365-9944.
• Berry-Kravis E, Grossman AW, Crnic LS, Greenough WT. Understanding fragile X syndrome. Curr Paediatr. 2002;12(4):316–324.

Определение HER2 статуса опухоли методом FISH

Определение HER-2 статуса опухоли методом FISH — исследование предрасположенности к развитию опухоли и подбор своевременного адекватного лечения при раке молочной железы (РМЖ) или раке желудка (РЖ).

HER-2 (HER-2/neu) — human epidermal growth factor receptor-2 — это белок, который может влиять на рост раковых клеток. Он создается специальным геном, который называется ген HER-2/neu. HER-2 является рецептором для определённого фактора роста, который называется человеческим эпидермальным фактором роста, естественным образом существующим у человека. Когда человеческий эпидермальный фактор роста прикрепляется к рецепторам HER-2 на раковых клетках груди, он может стимулировать рост и деление этих клеток. В здоровой ткани HER-2 передаёт сигналы, регулирующие пролиферацию и выживаемость клеток, но гиперэкспрессия HER-2 может обусловить злокачественную трансформацию клеток.

Гиперэкспрессия HER-2 при некоторых подтипах РМЖ ведёт к усилению пролиферации и ангиогенеза, нарушению регуляции апоптоза (генетически запрограммированного самоуничтожения клеток). Показано, что при раке молочной железы гиперэкспрессия этого рецептора в ткани опухоли ассоциирована с более агрессивным течением болезни, повышенным метастатическим потенциалом опухоли и менее благоприятным прогнозом. Открытие связи гиперэкспрессии HER-2 с неблагоприятным прогнозом РМЖ привело к поиску таких подходов к лечению, которые направлены на специфическое блокирование онкогена HER-2/neu (таргетная анти-HER2-терапия).

Рак молочной железы (РМЖ) — злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы. РЖМ занимает первое место среди всех злокачественных заболеваний у женщин.

В зависимости от наличия биологических маркёров опухоли — экспрессии гормональных рецепторов (эстрогена и/или прогестерона), экспрессии HER-2 — выделяют гормон-рецептор-положительный, HER-2-положительный и тройной негативный РМЖ.

HER-2/neu-положительные (HER-2+) типы рака молочной железы отличаются высокой экспрессией белка HER-2/neu.
HER=2/neu-негативные (HER-2-) типы рака молочной железы отличаются низкой экспрессией или отсутствием белка HER-2/neu.
Считается, что у одной из пяти женщин с раком груди опухоль является HER-2-положительной. Большинство раковых опухолей молочной железы являются гормонально-зависимыми: эстрогены и прогестерон оказывают на них стимулирующий эффект (пролиферативный и неопластический). При HER-2-положительном раке молочной железы на поверхности опухолевых клеток присутствует избыток HER-2-рецепторов. Данное явление носит название «положительный HER-2-статус» и диагностируется у 15–20% женщин, страдающих РМЖ.

HER-2 — рецептор эпидермального фактора роста человека 2-го типа, который присутствует в тканях и в норме, участвуя в регуляции деления и дифференцировки клеток. Его избыток на поверхности опухолевых клеток (гиперэкспрессия) предопределяет быстрый неконтролируемый рост новообразования, высокий риск метастазирования, низкую эффективность некоторых видов лечения. HER-2-положительный РМЖ является особенно агрессивной формой данного заболевания, поэтому точное определение HER-2-статуса имеет ключевое значение для выбора тактики лечения.

Рак желудка (РЖ) — злокачественная опухоль, происходящая из эпителия слизистой оболочки желудка.

РЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости и 2-е место в структуре онкологической смертности в мире. Заболеваемость РЖ у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин. Россия относится к регионам с высоким уровнем заболеваемости РЖ и смертности от данного заболевания. Диагностика РЖ на ранних стадиях затруднена из-за длительного бессимптомного течения заболевания. Часто РЖ выявляют на поздних стадиях, когда 5-летняя выживаемость не превышает 5–10%, а единственным методом лечения остаётся химиотерапия.

Основным методом лечения РЖ является хирургический. Однако у большинства пациентов на момент постановки диагноза определяется распространённый опухолевый процесс, что делает невозможным выполнение радикальной операции и требует проведения системной лекарственной терапии. Проведение химиотерапии статистически достоверно увеличивает общую выживаемость больных метастатическим РЖ, улучшая качество их жизни.

Онкоген HER-2 (erbB-2) был первоначально идентифицирован в опухолях молочной железы. Амплификация и гиперэкспрессия данного гена является относительно специфическим событием для карцином молочной железы и практически не встречается в опухолях других локализаций. Рак желудка представляется одним из немногих исключений: активация HER-2 отмечается примерно в 10–15% злокачественных новообразований этого органа и коррелирует с агрессивным течением заболевания.

Гиперэкспрессия HER-2 является фактором неблагоприятного прогноза. По данным разных исследований, амплификация гена HER-2 у больных РЖ коррелирует с низкими показателями общей выживаемости.

Для оценки HER-2-статуса при РЖ и РМЖ используют FISH метод.

FISH — исследования позволяет определять качественные и количественные изменения хромосом для диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Сегодня во всём мире широко применяются исследования методом FISH.

Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) — изучение числа HER-2/neu-генов внутри раковых клеток.

Показания:

• рак молочной железы — в целях прогноза и подбора терапии; 
• рак желудка — в целях прогноза и подбора терапии.

Подготовка
Определяется лечащим врачом.

Необходимы гистологический протокол и иммуногистохимический протокол, стекло ИГХ.

Интерпретация результатов
Результаты FISH-теста выражаются следующим образом:

1. Положительный (повышенное содержание, есть амплификация гена HER-2):

• HER-2-положительный рак молочной железы;
  

2. Негативный (нет амплификации гена HER-2):

• HER-2-отрицательный рак молочной железы.
  

Фиш-анализ при раке молочной железы: подготовка

Для лечения онкологических патологий ученные пока не разработали совершенных методов терапии, способствующих выздоровлению. Фиш-анализ при раке молочной железы дает надежду на ранее диагностирование заболевания. Метод позволит женщинам начать лечение на самых ранних этапах, что и повысит шансы на исцеление.

Что это такое?

Фиш-исследование при раке молочной железы является одним из прогрессивных и актуальных средств раннего диагностирования. В переводе с английского обозначает тест на внутриклеточную флуоресцентную гибридизацию. При помощи этого ген-теста онкологи анализируют происхождение опухолей. Также анализ указывает на положительное или отрицательное влияние гена, принимающего участие в патогенезе и прогрессировании рака агрессивного типа — HER2.

Постоянное развитие научных изысканий влияет на удешевление FISH-теста и делает его доступным все большему количеству женщин.

Вернуться к оглавлению

При каких симптомах рекомендуют проведение теста?

Для определения онкологии груди рекомендуется регулярно проводить самообследование. Первые симптомы, которые должны насторожить и побудить женщину пойти к врачу:

Увеличение лимфатических узлов в подмышках может сигнализировать про развитие заболевания.

• увеличение лимфатических узлов в подмышках;
• уплотнения в зоне груди;
• боль при нажатии на сосок;
• ассиметричность молочных желез;
• дискомфорт и боль в одной из грудей;
• выделения из сосков;
• морщинистая кожа на молочной железе;
• втянутый сосок.

Вернуться к оглавлению

Подготовка и сдача анализа

Никакой особой подготовки для прохождения на фиш-тест не требуется. Нельзя только употреблять спиртные напитки, как и перед сдачей любых анализов и употреблять жирную, мясную и тяжелую пищу. Еда должна быть легкой, лучше, если это будут овощные блюда и соки. Fish-тест при раке молочной железы — безвредная и безопасная процедура, которая проходит в два этапа:

• Гистологический. Под местным воздействием наркоза проводится биопсия биоматериала из груди. Полученный материал обрабатывается специальным красящим веществом с флуоресцентными маркерами. По своим химическим качествам эти маркеры связываются исключительно с обозначенными хромосомами и их наборами в клетках. В результате исследований видны наиболее окрашенные маркером хромосомные наборы, что и указывает на степень изменений в геноме по онкологической принадлежности.
• Фиш-анализ. В вену проводят инфузию компонента ДНК — дезоксирибонуклеиновую кислоту, окрашенную специфическими маркерами. Метки-маркеры встраиваются в геномы на клеточном уровне. Исследование проводится в присутствии пациентки, а итоги анализа предоставляются сразу.

Вернуться к оглавлению

Что показывают результаты?

Гистология молочной железы дает возможность установить разновидность опухоли и причины ее появления.

Fish-анализ при раке молочной железы показывает такие итоги:

• Гистологическое исследование. Результаты выставляются по насыщенности маркеров на участках хромосомных наборов. Число 1 и менее означает, что опасности нет. Цифра обозначает пограничное состояние, требующее дополнительных анализов. Числом 3 обозначают развитие онкологического процесса.
• Фиш-реакция при раке молочной железы. Отрицательный результат реакции означает, что молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты не принимают участия в патогенезе атипичных клеток. При развитии злокачественного образования ген HER2 не влияет на раковую клетку. При положительной реакции в два раза повышается скорость деления генов, участвующих в патогенезе онкологических молекул.

Вернуться к оглавлению

Достоинства и недостатки

Плюсом фиш-анализа является:

• Скорость. Результаты готовы в течение нескольких дней.
• Обнаружение предрасположенностей к другим патологиям.
• Безопасность. Биопсия проводится с наименьшим травмирование пациентки.
• Выявление склонности к раковым заболеваниям.

Фиш-тесты согласно источнику maximus2012.nethouse.ru/static/doc/0000/0000/0349/349982.sqrj348c07.pdf позволяют установить, насколько организм склонен к онкологии.

К минусам можно отнести такие показатели:

• Специфичность маркеров. Их не применяют на некоторых зонах хромосомного набора.
• Не всегда правильные результаты, иногда случаются ошибки.
• Высокая стоимость процедуры.

При наименьших подозрениях на изменение молочных желез необходимо обратиться к маммологу. Существует целый спектр методов исследований на онкологию, в том числе и фиш-тест. Чем раньше будет обнаружен рак или предрасположенность к нему, тем раньше начнется лечение, и тем более благоприятным будет прогноз выживаемости.

Что показывает анализ fish 17. FISH – исследование для дифференциальной диагностики

FISH-тест – это один из наиболее современных способов анализа хромосомного набора. Сама аббревиатура «FISH» сложилась из английского названия методики — флуоресцентная гибридизация in situ. Данный тест позволяет с высокой точностью (включая конкретные гены и их сегменты) изучить генетический материал клетки.

Этот способ сегодня используется для диагностики некоторых типов раковых опухолей, так как злокачественное перерождение клетки обусловлено изменениями ее генома. Соответственно, обнаружив характерные нарушения в генах, можно с высокой достоверностью отнести эту клетку к раковым. Кроме того, FISH-тест применяется и для подтверждения уже установленного диагноза, а также для получения дополнительных данных о возможности применения специфических химиопрепаратов с целью проведения процедуры химиотерапии при раке груди и уточнения прогноза заболевания.

Хорошим примером использования FISH-теста может послужить его проведение у пациентов с раковой опухолью молочной железы. С помощью этой методики ткани, полученные при биопсии, исследуются на наличие копий гена под названием HER-2. Если этот ген присутствует, это означает, что на поверхности клеток расположено большое число HER2-рецепторов. Они чувствительны к сигналам, стимулирующим развитие и размножение опухолевых элементов. В этом случае открывается возможность для эффективного использования трастузумаба – этот препарат блокирует активность HER2-рецепторов, а значит, угнетает рост опухоли.

Как проводится FISH-тест?

В ходе обследования в биоматериал, полученный от пациента, вводится специальное вещество-краситель, содержащее флуоресцентные метки. Их химическая структура такова, что они способны связываться исключительно с четко определенными участками хромосомного набора клетки. После этого окрашенный тканевой образец помещается под флуоресцентный микроскоп. Если исследователь обнаруживает участки хромосом с присоединенными к ним светящимися метками, то это является показателем отклонений, которые свидетельствуют о наличии изменений генома, относящихся к онкологическому типу.

Эти отклонения в структуре хромосом бывают нескольких видов:
транслокация – перемещение части хромосомного материала на новую позицию в пределах той же самой или другой хромосомы;
инверсия – поворот части хромосомы на 1800 без отделения от основного ее тела;
делеция – потеря какого-либо хромосомного участка;
дупликация – копирование части хромосомы, что приводит к увеличению количества копий одного и того же гена, содержащегося в клетке.

Каждое их таких нарушений несет в себе определенные диагностические признаки и информацию. Так, например, транслокации могут свидетельствовать о наличии лейкемий, лимфом или сарком, а наличие генных дупликаций помогает назначить наиболее эффективную терапию.

В чем преимущество FISH-теста?

По сравнению с традиционными анализами генетического материала клеток, FISH-тест обладает намного большей чувствительностью. Он позволяет выявлять даже самые незначительные изменен