Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии ( Коллектив авторов, 2014)

Глава 2.

ПЕРВИЧНЫЕ АНТИТЕЛА

2.1. Антитела – компоненты сыворотки крови

Антитела – это растворимые гликопротеины глобулиновой фракции сыворотки крови и других биологических жидкостей, образующиеся в ответ на введение или проникновение антигена (чужеродных веществ, в том числе бактерий, вирусов, токсинов) в организм теплокровных животных (Ройт А. [и др.], 2000). На сегодняшний день антитела являются наиболее важными реагентами для использования в фундаментальных и прикладных исследованиях, что обусловлено их способностью к высокоспецифическому связыванию с антигеном, вызвавшим их образование.

Применяя определенные методические приемы, можно добиться образования антител к практически неограниченному набору антигенов. Однако стоит отметить, что стоимость коммерческих антител и затраты на их получение в условиях лаборатории могут различаться в десятки раз в зависимости от требуемой чистоты, специфичности и области применения, поэтому еще на этапе планирования исследования стоит уделить особое внимание правильному подбору антител. В этом может помочь и данное руководство.

2.2. Строение антител

Классические антитела представляют собой крупные мультимерные белки. Основная четырехцепочечная структурная единица иммуноглобулинов образована полипептидными цепями двух разных типов. Меньшие по размеру цепи (легкие L-цепи) имеют молекулярную массу около 25 кДа и состоят из вариабельного VL- и константного СL-доменов. Более крупные (тяжелые H-цепи) имеют молекулярную массу 50 – 80 кДа, состоят из вариабельного VH-, трех константных СН1-, СН2-, СН3-доменов и шарнирного участка (hinge region). Полипептидные цепи удерживаются вместе ковалентными (дисульфидными) и нековалентными связями (Ройт А. [и др.], 2000). Схематически «типичная» структура антитела представлена на рис. 1.

Рис. 1. Структура кроличьего иммуноглобулина IgG. Тяжелые и легкие цепи образуют вариабельный и константный домены, которые соединены дисульфидными мостиками (♦). При помощи папаина (цистеиновой эндопротеазы) протеолиз разделяет молекулу, в результате чего образуются два антигенсвязывающих фрагмента (Fab) и один кристаллизующийся фрагмент (Fc). Под действием пепсина (аспартатной кислой эндопептидазы) происходит отщепление двухвалентного антигенсвязывающего фрагмента (Fab′)2 (по: Boenisch T., 2001; с изменениями)

В зависимости от размера, заряда, аминокислотной последовательности и содержания углеводов в составе тяжелой цепи различают пять изотипов (классов) антител: IgM, IgG, IgA, IgE и IgD. Класс IgG подразделяется на четыре подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), которые различаются по антигенной структуре и спектру биологических функций (Burton D. R. [et al.], 1996). IgG – это наиболее широко представленный класс иммуноглобулинов, на его долю приходится 70 – 75 % их общего количества. Класс IgA разделяют на два подкласса (IgA1, IgA2). Все классы и подклассы составляют девять изотипов, которые присутствуют в норме у всех теплокровных. Кроме того, IgM является пентамером, т. е. пять молекул соединяются между собой, а IgA – димером.

При помощи папаина антитела можно расщепить на два одинаковых антигенсвязывающих Fab-фрагмента (fragment antigen binding) и Fc-фрагмент (fragment cristalizable), способный к кристаллизации. Область Fab образована гипервариабельными участками Ни L-цепей и определяет антигенную специфичность; Fc-фрагмент осуществляет эффекторные функции (связывание иммуноглобулина с клетками, компонентами комплемента) (Atassi M. Z., 1984). К Fc-фрагменту антител можно присоединять различные вещества, что используется при постановке иммунохимических реакций.

В 1993 г. группой бельгийских ученых было сделано важное открытие: кроме классических антител в крови некоторых животных (верблюдов, лам и др.) обнаруживаются особые, неканонические антитела с упрощенной структурой. Они состоят из димера укороченной (без Ch2-домена) тяжелой цепи; легкая цепь отсутствует, т. е. антигенузнающий участок формируется лишь вариабельными доменами тяжелых цепей. Такие антитела принято называть однодоменными антителами, или мини-антителами. Благодаря малым размерам (молекулярная масса однодоменных антител составляет примерно 12 – 15 кДа) и компактности антигенсвязывающего участка, можно получить мини-антитела, способные узнавать участки антигенов, недоступные для классических антител, в этом состоят весомые преимущества мини-антител (Тиллиб С. В., 2011).

2.3. Особенности связывания антитела с антигеном

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген – антитело». Антигенами обычно являются высокомолекулярные белки и полисахариды, реже – полипептиды, липиды и нуклеиновые кислоты. Иммунный ответ могут вызывать и небольшие молекулы, или гаптены, в том случае если они соединяются с высокомолекулярными носителями (белками, полисахаридами). В качестве гаптенов могут выступать лекарственные вещества, моно- и полисахариды, небольшие полипептиды, фосфолипиды, триглицериды, моноамины.

Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом. Обычно в эпитоп входит от одной до шести молекул моносахаридов или аминокислот, расположенных на поверхности антигена. Антитела распознают не отдельные химические группы в структуре антигена, а пространственную форму эпитопов. Они способны улавливать различия в распределении зарядов на поверхности антигена, оптическую и стереоизомерию, минимальные различия в первичной структуре. Вследствие этого б|ольшая часть антител способна связываться только с нативными антигенами или с фрагментами антигена, сохраняющими третичную структуру. Следовательно, для успешного взаимодействия антигена и антитела эпитоп должен находиться на поверхности молекулы. Следует учитывать, что при денатурации молекул (например, под действием фиксирующих жидкостей, экстремальных значений pH буферных растворов и др.) эпитоп может повышать или понижать свою иммуногенность.

Большие молекулы (например, белки) имеют несколько эпитопов, поэтому они стимулируют образование антител нескольких видов к разным эпитопам одного и того же антигена. Такие антитела называют поликлональными. Они более толерантны к незначительным конформационным изменениям антигена (полиморфизму, различной степени гликозилирования, фосфорилирования, частичной денатурации), что дает больше возможностей экспериментатору при планировании исследований.

Антитела, реагирующие с одним единственным эпитопом, называют моноклональными. В отличие от поликлональных антител, они чувствительны даже к небольшим конформационным изменениям антигена. Например, можно получить моноклональные антитела, узнающие молекулу белка, фосфорилированную по определенному сайту. Благодаря высокой специфичности моноклональные антитела являются отличными первичными антителами, то есть антителами для выявления искомого антигена, так как они дают слабое неспецифическое связывание, а значит, и меньшее фоновое окрашивание. По сравнению с поликлональными антителами они обладают большей гомогенностью, что обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Однако связывание с единственным эпитопом обусловливает низкую чувствительность, проявляющуюся в слабом иммуноокрашивании на срезах. К тому же высока вероятность того, что фиксатор сделает этот единственный эпитоп недоступным для антител, в результате чего иммуноокрашивания вообще не произойдет. Кроме того, методы получения моноклональных антител более сложные и трудоемкие, чем методы получения поликлональных иммунных сывороток, что приводит к значительному увеличению их стоимости.

До недавнего времени большинство моноклональных антител являлись иммуноглобулинами мыши. Поэтому в исследовательской практике работы с лабораторными животными (мышами и крысами) применять их было неудобно из-за перекрестного взаимодействия вторичных реагентов с собственными иммуноглобулинами животного. За последние несколько лет появилось много новых моноклональных антител, являющихся кроличьими иммуноглобулинами (например, клоны SP от Spring Bioscience). Считается, что кроличьи моноклональные антитела позволяют добиться лучшей визуализации антигена по сравнению с мышиными. По крайней мере, у кроличьих моноклональных антител имеется очевидное преимущество: их удобно выявлять стандартными вторичными реагентами при проведении исследований с использованием мышей и крыс в качестве лабораторных животных.

2.4. Получение и очистка антител

Поликлональные антитела получают путем иммунизации лабораторных животных. Обычно для этих целей используют кроликов, морских свинок или коз. Важно соблюдать принцип чужеродности иммуногена. Установлено, что чем сильнее антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность. Например, инсулины человека и кролика имеют близкую первичную структуру, и поэтому для кролика инсулин человека малоиммуногенен. Между инсулином человека и морской свинки имеются достаточные отличия, что позволяет использовать этих животных как продуцентов соответствующих антисывороток (Фримел Г. М., 1987; Herschowitz H. I. D., 1985).

В общем случае способность антигена стимулировать продукцию антител зависит от ряда факторов. Так, с повышением молекулярной массы полимерных молекул повышается их иммуногенность. Для белков пороговый размер молекулы, определяющий появление иммуногенности, – 7 – 10 аминокислот. Это количество аминокислот, позволяющее сформировать α-спираль. Кроме этого, иммуногенность растет с повышением количества повторяющихся антигенных детерминант в составе антигена и зависит от жесткости структуры антигена, т. е. способности сохранять определенную структуру. Иммуногенность одного и того же антигена зависит от генотипа и может различаться у индивидуумов, имеющих разные отдельные варианты генов главного комплекса системы гистосовместимости, поэтому обычно одновременно иммунизируют нескольких животных (Фримел Г. М., 1987).

Слабоиммуногенные антигены необходимо вводить со стимуляторами иммуногенеза (адъювантами). Наиболее часто используют адъювант Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии. Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон концентраций вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. Однако после введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного.

В ходе первичного иммунного ответа обычно образуются иммуноглобулины класса IgM, продукция которых сменяется синтезом иммуноглобулинов других изотипов. Получаемые описанным выше способом антитела в большей части относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. Однако ответ на некоторые антигены ограничивается синтезом IgM-антител (Haunghton G. [et al.], 1993).

В сывороточных средах содержание антител не превышает 10 % общего количества белка, поэтому для удаления примесных белков и ДНК необходимы высокоэффективные методы очистки. Для очистки антител применяется фракционирование сульфатом аммония. Последующая ионообменная хроматография обеспечивает чистоту антител на уровне только 90 %, поэтому для дальнейшей очистки необходимо использовать дополнительные методы, например гель-фильтрацию. В настоящее время большее распространение получил метод очистки антител с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А или белке G. Этот метод очистки более быстрый (одностадийный) и позволяет получать антитела с чистотой более 95 %.

Моноклональные антитела получают с помощью метода гибридомной технологии. Гибридомы – это клоны – продуценты моноклональных антител. Для их получения лабораторные животные подвергаются иммунизации, затем из их селезенки выделяют иммунные В-лимфоциты (клетки, способные к продукции специфических клонов антител). Их соединяют с клетками миеломы (соматическая гибридизация), которые сами не могут производить специфические антитела, но способны к неограниченному размножению in vitro. После слияния клетки в течение 10 – 14 дней поддерживают в среде. Поскольку не все находящиеся в культуре клетки образованы путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки, которые находятся в среде, делят на линии, которые культивируют в отдельных ячейках. Далее в культуральной среде определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. Отобранные клетки вводят в брюшную полость мышей, где гибридома размножается, подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости). Асцитная жидкость содержит гомогенные моноклональные антитела в высокой концентрации (1 – 10 мг/мл) (Кеннет Р. Г. [и др.], 1983; Альтшулер E. П. [и др.], 2010).

Существуют методы получения антител и без использования лабораторных животных. Один из них основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу. Второй представляет собой культивирование клеток в гомогенной суспензии. Затруднения в использовании данных технологий возникают в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител.

2.5. Хранение антител

В зависимости от способа очистки и индивидуальных особенностей конкретных антител транспортировка и хранение осуществляются в одной из следующих форм:

1. Лиофилизированные антитела. Перед первым использованием такие антитела необходимо растворить в буфере, состав которого указан производителем, аликвотировать. Как правило, их хранят при –20 °C, не допуская повторного размораживания. Допускается длительная транспортировка, не требующая особых температурных условий.

2. Концентрированный раствор антител. Обычно это 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,2 – 7,4) или 10 мМ HEPES (pH 7,4 – 7,5). В буфер добавляют инертный белок, например 1,0 % бычий сывороточный альбумин (BSA), который конкурирует с антителами за места неспецифического связывания на стенках посуды. В качестве криопротектора, защищающего антитела от разрушения при замораживании, используют глицерин (до 50,0 % по массе). В целях предотвращения грибкового и бактериального заражения раствора антител обычно применяют 0,1 % азид натрия. Необходимо обратить внимание на то, что последний является ингибитором пероксидазы! Подбирая антитела, следует тщательно анализировать состав буфера для их хранения. Так, азид натрия можно заменить тимерозалом (до 0,02 %). Иногда в раствор добавляют меркаптоэтанол (до 0,10 %), что необходимо для предотвращения образования дисульфидных связей между субъединицами антител. Перед первым использованием такие антитела также необходимо аликвотировать и хранить при –20 °C (или –70 °C), не допуская повторного размораживания (Boenisch T., 2001).

3. Раствор антител, готовый к употреблению. Этот раствор хранится при температуре 4 – 8 °C и не требует дальнейшего разведения. Если планируется использовать коммерческие антитела, то необходимо внимательно ознакомиться с прилагаемой к ним инструкцией, в которой указаны условия хранения, оптимальные для поддержания активности антител, и следовать ей.

Альтшулер E. П., Серебряная Д. В., Катруха А. Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности // Усп. биол. химии. – 2010. – Т. 50. – С. 203 – 258.

Кеннет Р. Г., Мак-Керн Т. Дж., Бехтол К. Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. – М.: Медицина, 1983.

Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. – М.: Мир, 2000.

Тиллиб С. В. Верблюжьи антитела – эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии // Мол. биол. – 2011. – Т. 1. – С. 77 – 85.

Фримел Г. Иммунологические методы. – М.: Медицина, 1987.

Atassi M. Z. Molecular Immunology. – New York: Marcel Decer, Inc., 1984.

Boenisch T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents // Appl. Immunohistochem. – 2001. – Vol. 9. – P. 176 – 179.

Burton D. R., Gregory L., Jefferis R. Aspects of the molecular structure of IgG subclasses // Monogr. Allergy. – 1986. – Vol. 19. – P. 7 – 35.

Haunghton G., Larry W. A., Whitmore A. B-1 cells are made, not born // Immunology Today. – 1993. – Vol. 14. – P. 84 – 86.

Herschowitz H. I. D. Immunophysiology: Cell function and cellular interactions in antibody formation // Immunology III / Ed. J. A. Bellanti. – Philadelphia: Saunders, 1985.

первичный и вторичный иммунный ответ. Иммунологическая память.

Антителообразование — образование специфических иммуноглобулинов, индуцированное антигеном; происходит главным образом в зрелых плазматических клетках, а также в плазмобластах и лимфобластах.

Основная масса антител образуется в клетках плазмоцитарного ряда (плазмобласт, проплазмоцит, плазмоцит). Каждая из них продуцирует антитела только одной специфичности, т. е. к одной антигенной детерминанте.

Иммунный ответ — последовательно развертывающаяся многоуровневая реакция антител и иммунных органов на антиген, сопровождающаяся гемодинамическими сдвигами.

При первичном контакте организма с антигеном и антителообразовании различают индуктивную и продуктивные фазы. Продолжительность первой фазы составляет около 2 суток. В этот период происходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток, развитие плазмобластической реакции. Вслед за индуктивной наступает продуктивная фаза. В сыворотке крови антитела начинают определяться с З-го дня после контакта с антигеном. Эти антитела относятся к классу IgM. С 5–7 дня происходит постепенная смена синтеза IgM на синтез IgG той же специфичности. Обычно к 12—15 дню кривая антителообразования достигает максимума, далее уровень антител начинает снижаться, но определенное их количество можно обнаружить и через много месяцев, а иногда и лет. При повторном контакте организма с тем же антигеном индуктивная фаза занимает лишь несколько часов. Продуктивная фаза протекает быстрее и интенсивнее, осуществляется синтез преимущественно IgG.

Первичный иммунный ответ — наработка АТ и последующее связывание АГ с АТ- как реакция на первую встречу с новым АГ. Во внеутробной жизни человека непрерывно происходят реакции готовых антител с АГ — вторичный иммунный ответ. Характер иммунного ответа зависит от многих факторов: исходной активности иммунной системы, вида АГ, способа поступления в организм, количества и динамики поступления и т.д., состояния организма (возраста, образа жизни, питания, т.д.) и др.

Первичный иммунный ответ развивается после первого контакта с антигеном. Для него характерны следующие особенности.

– Наличие латентного периода (2-3 дня после первого контакта с антигеном). Это связано с отсутствием лимфоцитов памяти. Все клоны лимфоцитов находятся в фазе покоя G0. При поступлении в организм антигена вначале синтезируются IgM (антитела выявляются через 2-3 суток), а затем – IgG (пик приходится на 10-14 сутки, причем эти антитела могут сохранятся в низком титре в течение всей жизни). Отмечается также небольшое увеличение уровней IgA, IgE и IgD. Образуются комплексы антиген-антитело.

– Уже с третьих суток появляются иммунные Т-лимфоциты.

– Первичный иммунный ответ затихает через 2-3 недели после стимуляции антигеном.

– Появляются лимфоциты памяти и может долго поддерживаться следовой уровень IgG.

Б. Вторичный иммунный ответ развивается после повторного контакта с тем же антигеном и имеет следующие особенности.

– В организме уже имеются долгоживущие клоны антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов памяти, ответственных за «память» об антигене и способных к рециркуляции, они находятся не в покое, а в фазе G1.

– Стимуляция синтеза антител и иммунных Т-лимфоцитов наступает через 1-3 дня.

– Т-клетки памяти быстро превращаются в эффекторные.

– Количество антител сразу резко увеличивается, причем синтезируются иммуноглобулины высокой специфичности – IgG.

– Чем больше контактов с антигенами имело место в данном организме, тем выше будет концентрация и специфичность антител.

Иммунологическая память. При повторной встрече с антигеном организм формирует более активную и быструю иммунную реакцию — вторичный иммунный ответ. Этот феномен получил название иммунологической памяти.

Иммунологическая память имеет высокую специфичность к конкретному антигену, распространяется как на гуморальное, так и клеточное звено иммунитета и обусловлена В- и Т-лимфоцитами. Она образуется практически всегда и сохраняется годами и даже десятилетиями. Благодаря ней наш организм надежно защищен от повторных антигенных интервенций.

Феномен иммунологической памяти широко используется в практике вакцинации людей для создания напряженного иммунитета и поддержания его длительное время на защитном уровне. Осуществляют это 2—3-кратными прививками при первичной вакцинации и периодическими повторными введениями вакцинного препарата — ревакцинациями.

принципиальная схема получения, преимущество и практическое применение

Динамика образования антител . Синтез антител протекает в две фазы. Первая — индуктивная, которая длится 3-5 суток от момента введения антигена до появления антител в крови. Вторая — продуктивная, когда антитела появляются в крови, количество их нарастает к 15-30 суткам и затем снижается. Иммунный ответ после первого введения антигена называют первичным. Особенностью его является то, что первоначально синтезируются IgM, затем IgG.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении того же антигена и отличается от первичного следующими особенностями, индуктивная фаза короче (1-2 суток), уровень антител нарастает быстрее, достигает более высоких значений и сохраняется дольше, медленно снижаясь в течение нескольких лет При вторичном иммунном ответе с самого начала образуются IgG. Более быстрая и сильная выработка антител при вторичном иммунном ответе объясняется тем, что после первичного введения в организме остаются «клетки памяти», которые при вторичном введении того же антигена быстро размножаются и интенсивно включают процесс образования антител.

В практической медицине учитываются особенности динамики антителообразования:

1) при составлении рациональных графиков вакцинации с определенными интервалами;

2) при экстренной профилактике столбняка людям, получившим травму, если они были ранее привиты столбнячным анатоксином, вводят не антитоксическую сыворотку, которая может дать нежелательные аллергические реакции, а анатоксин, — в расчете на быстрый и сильный иммунный ответ;

3) при серологической диагностике дифференцируют первичное заболевание сыпным тифом от рецидива (болезни Брилля) по наличию в крови больного IgM.

Виды антител. Принято различать полные и неполные антитела. Полные антитела имеют не менее двух активных центров, поэтому при постановке реакции агглютинации, преципитации и других реакций иммунитета они обусловливают видимый эффект. Неполные антитела способны соединяться с антигеном, но видимой реакции агглютинации или преципитации не наблюдается. Причина в том, что неполные антитела имеют только один активный центр, способный соединяться с антигеном (второй блокирован). Неполными являются антитела к резус-антигену эритроцитов. При многих инфекциях они появляются наряду с полными антителами. Для выявления неполных антител используют реакцию Кумбса.

По характеру действия антитела разделяют на антимикробные, антитоксические, вируснейтрализующие, гемолизины, аутоантитела и др. Антимикробные антитела вызывают агглютинацию бактерий или преципитацию антигенов, извлеченных из них, лизис бактерий при участии комплемента, усиление фагоцитоза — опсонизацию; антитоксины нейтрализуют токсины; вируснейтрализующие антитела оказывают противовирусное действие. Аутоантитела вырабатываются организмом против собственных белков и клеток при изменении их химической структуры или при освобождении антигенов из разрушившихся органов и тканей, или при утрате естественной нммунологической толерантности к каким-то собственным антигенам.

Моноклональные антитела. При введении антигена в иммунный ответ вовлекается множество лимфоцитов. Они могут различаться между собой по специфичности, различия эти могут быть совсем незначительными. Однако при иммунизации даже таким антигеном, который содержит одну детерминантную группу, образуются антитела, различающиеся по своей специфичности.

Для получения антител одной специфичности необходимо получить потомство-клон (греч. klon — отпрыск, ветвь) из одного лимфоцита. Но культуру лимфоцитов в искусственной питательной среде получить трудно (вследствие ограниченного числа делений и времени жизни клетки). Только опухолевые клетки могут культивироваться in vitro без ограничения при условии поступления питательных веществ .

Задачу получения культуры клеток, полученных из одного лимфоцита и способных длительно размножаться в питательной среде, решили Г.Келер и К. Мильштейн (1975 г., Нобелевская премия, 1984 г.). Авторы разработали методику получения гибридом (гибридных клеток) от слияния лимфоцитов иммунизированных животных с миеломными (опухолевыми) клетками. Слияние осуществляется с помощью полиэтиленгликоля или электрического разряда. Полученные гибридомы наследуют от лимфоцита способность синтезировать специфическое антитело, а от миеломной клетки способность бесконечно размножаться в питательной среде in vitro. Синтезируемые гибридомами антитела могут быть получены в неограниченном количестве. Антитела идентичны и по специфичности, и по классу иммуноглобулинов. Таким образом, полученный in vitro препарат может служить идеальным по специфичности средством для диагностики и лечения (рис. 19).

62. Основные группы серологических реакций. Характеристика реакций для прямого определения антител и антигенов, реакции пассивной агглютинации, методов с применением меченых антител и антигенов

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых планшетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде «кружевного зонтика», при отрицательной реакции — плотный осадок эритроцитов в виде «пуговки».

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Реакции с участием меченых антигенов или антител основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сыворотка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти-оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.

Прямой метод РИФ. Из исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), готовят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресцирующей сывороткой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае — противохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдают светящиеся микробы.

Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь большой набор флюоресцирующих сывороток против каждого антигена.

Непрямой метод РИФ. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем — флюоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблюдают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.

При использовании этого метода можно иметь одну флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена (рис. 20). Первый этап — адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей.

Второй этап — добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап — добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. В качестве

фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.

2) Обнаружение антител. Первый этап — адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы — в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап — добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап — после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются «безреагентные» системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг — это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА.

63. Реакция нейтрализации токсина антитоксином; механизмы и ингредиенты (получение токсина и антитоксической сыворотки, единицы измерения). Применение для определения уровня антитоксического иммунитета (название реакции, постановка), применение с диагностической целью (на примере диагностики ботулизма или столбняка)

В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами — антитоксины. При их взаимодействии происходит нейтрализация токсина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитоксической сыворотки. Внешнее проявление реакции — флоккуляция (помутнение). Для обнаружения токсина с диагностической целью при ботулизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксином в биологическом опыте на животных.

Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности AT связывать различные возбудители и их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои биологические свойства (иными словами, AT нейтрализуют возбудителей). На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В определённой степени к ним же относят реакции торможения вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.

РН вирусов. В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют AT, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением лабораторному животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах.

РН токсинов применяется для идентификации бактериальных экзотоксинов по видовой и типовой их принадлежности, а также для определения содержания антитоксинов в исследуемой сыворотке. Принцип основан на способности антитоксинов связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических АТ их смесь вводят лабораторным животным. При соответствии типа токсина и антисывороткии гибели животных не наблюдают. Нейтрализацию токсинов in vitro определяют в реакции флоккуляции. Для определения антитоксического иммунитета у человека часто применяют кожные пробы (например, пробу Шика).

первичный и вторичный иммунный ответ. Иммунологическая память.

Антителообразование — образование специфических иммуноглобулинов, индуцированное антигеном; происходит главным образом в зрелых плазматических клетках, а также в плазмобластах и лимфобластах.

Основная масса антител образуется в клетках плазмоцитарного ряда (плазмобласт, проплазмоцит, плазмоцит). Каждая из них продуцирует антитела только одной специфичности, т. е. к одной антигенной детерминанте.

Иммунный ответ — последовательно развертывающаяся многоуровневая реакция антител и иммунных органов на антиген, сопровождающаяся гемодинамическими сдвигами.

При первичном контакте организма с антигеном и антителообразовании различают индуктивную и продуктивные фазы. Продолжительность первой фазы составляет около 2 суток. В этот период происходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток, развитие плазмобластической реакции. Вслед за индуктивной наступает продуктивная фаза. В сыворотке крови антитела начинают определяться с З-го дня после контакта с антигеном. Эти антитела относятся к классу IgM. С 5–7 дня происходит постепенная смена синтеза IgM на синтез IgG той же специфичности. Обычно к 12—15 дню кривая антителообразования достигает максимума, далее уровень антител начинает снижаться, но определенное их количество можно обнаружить и через много месяцев, а иногда и лет. При повторном контакте организма с тем же антигеном индуктивная фаза занимает лишь несколько часов. Продуктивная фаза протекает быстрее и интенсивнее, осуществляется синтез преимущественно IgG.

Первичный иммунный ответ — наработка АТ и последующее связывание АГ с АТ- как реакция на первую встречу с новым АГ. Во внеутробной жизни человека непрерывно происходят реакции готовых антител с АГ — вторичный иммунный ответ. Характер иммунного ответа зависит от многих факторов: исходной активности иммунной системы, вида АГ, способа поступления в организм, количества и динамики поступления и т.д., состояния организма (возраста, образа жизни, питания, т.д.) и др.

Первичный иммунный ответ развивается после первого контакта с антигеном. Для него характерны следующие особенности.

– Наличие латентного периода (2-3 дня после первого контакта с антигеном). Это связано с отсутствием лимфоцитов памяти. Все клоны лимфоцитов находятся в фазе покоя G0. При поступлении в организм антигена вначале синтезируются IgM (антитела выявляются через 2-3 суток), а затем – IgG (пик приходится на 10-14 сутки, причем эти антитела могут сохранятся в низком титре в течение всей жизни). Отмечается также небольшое увеличение уровней IgA, IgE и IgD. Образуются комплексы антиген-антитело.

– Уже с третьих суток появляются иммунные Т-лимфоциты.

– Первичный иммунный ответ затихает через 2-3 недели после стимуляции антигеном.

– Появляются лимфоциты памяти и может долго поддерживаться следовой уровень IgG.

Б. Вторичный иммунный ответ развивается после повторного контакта с тем же антигеном и имеет следующие особенности.

– В организме уже имеются долгоживущие клоны антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов памяти, ответственных за «память» об антигене и способных к рециркуляции, они находятся не в покое, а в фазе G1.

– Стимуляция синтеза антител и иммунных Т-лимфоцитов наступает через 1-3 дня.

– Т-клетки памяти быстро превращаются в эффекторные.

– Количество антител сразу резко увеличивается, причем синтезируются иммуноглобулины высокой специфичности – IgG.

– Чем больше контактов с антигенами имело место в данном организме, тем выше будет концентрация и специфичность антител.

Иммунологическая память. При повторной встрече с антигеном организм формирует более активную и быструю иммунную реакцию — вторичный иммунный ответ. Этот феномен получил название иммунологической памяти.

Иммунологическая память имеет высокую специфичность к конкретному антигену, распространяется как на гуморальное, так и клеточное звено иммунитета и обусловлена В- и Т-лимфоцитами. Она образуется практически всегда и сохраняется годами и даже десятилетиями. Благодаря ней наш организм надежно защищен от повторных антигенных интервенций.

Феномен иммунологической памяти широко используется в практике вакцинации людей для создания напряженного иммунитета и поддержания его длительное время на защитном уровне. Осуществляют это 2—3-кратными прививками при первичной вакцинации и периодическими повторными введениями вакцинного препарата — ревакцинациями.

39.3. Первичный и вторичный иммунный ответ

В зависимости от характера контакта с антигеном (а точнее – наличием в организме клеток иммунологической памяти, несущих рецептор к причинному антигену) различают первичный и вторичный иммунный ответ (Рис. 39.3-1).

Рис. Рис. 39.3-1. Общая схема гуморального и клеточного иммунного ответа на Т-зависимые и Т-независимые антигены

А. Первичный иммунный ответ развивается после первого контекта с антигеном. Для него характерны следующие особенности.

– Наличие латентного периода (2-3 дня после первого контакта с антигеном). Это связано с отсутствием лимфоцитов памяти. Все клоны лимфоцитов находятся в фазе покоя G0. При поступлении в организм антигена вначале синтезируются IgM (антитела выявляются через 2-3 суток), а затем – IgG (пик приходится на 10-14 сутки, причем эти антитела могут сохранятся в низком титре в течение всей жизни). Отмечается также небольшое увеличение уровней IgA, IgE и IgD. Образуются комплексы антиген-антитело.

– Уже с третьих суток появляются иммунные Т-лимфоциты.

– Первичный иммунный ответ затихает через 2-3 недели после стимуляции антигеном.

– Появляются лимфоциты памяти и может долго поддерживаться следовой уровень IgG.

Б. Вторичный иммунный ответ развивается после повторного контакта с тем же антигеном и имеет следующие особенности.

– В организме уже имеются долгоживущие клоны антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов памяти, ответственных за «память» об антигене и способных к рециркуляции, они находятся не в покое, а в фазе G1.

– Стимуляция синтеза антител и иммунных Т-лимфоцитов наступает через 1-3 дня.

– Т-клетки памяти быстро превращаются в эффекторные.

– Количество антител сразу резко увеличивается, причем синтезируются иммуноглобулины высокой специфичности – IgG.

– Чем больше контактов с антигенами имело место в данном организме, тем выше будет концентрация и специфичность (аффинность) антител.

39.4. Кооперативный механизм действия и регуляции иммунной системы

Кооперативные механизм действия и регуляции иммунной системы осуществляется на двух уровнях.

А. Внутри иммунной системы кооперация и регуляция осуществляется посредством межклеточных взаимоотношений иммуноцитов и «нанятых» иммунной системой клеток, в том числе с помощью цитокинов.

Б. Межсистемная кооперация и регуляция иммунной системы осуществляется на уровне организма с вовлечением центральной нервной и эндокринной систем (Рис. 39.4-1), алгоритм которой впервые предложил П.Ф.Здродовский (гипоталамоадреналовая теория иммунитета Здродовского). О вовлечении системы иммунитета в месистемную кооперацию на организменном уровне свидетельствуют следующие факты.

Рис. 39.4-1. Функциональная связь иммунной, эндокринной и нервной систем

13Г. Тестовые вопросы по теме занятия

В ходе иммунного ответа антигенпрезентирующая клетка представляет антиген:

-нулевому (наивному) Т-хелперу

Т-хелперу первого типа

Т-хелперу второго типа

Т-киллеру

Т-супрессору

Восприняв сигнал от антигенпрезентирующей клетки, нулевой (наивный) Т-хелпер додифференцируется в:

Т-хелпер первого типа

-Т-хелпер второго типа

Т-киллер

Т-супрессор

Т-эффектор ГЗТ

Синтез каких цитокинов характерен для Т-хелпера второго типа:

интерлейкин-2

-интерлейкин-4

-интерлейкин-5

-интерлейкин-6

Сигнал активации В-лимфоцитов:

интерлейкин-2

-интерлейкин-4

интерлейкин-5

интерлейкин-6

Сигнал пролиферации активированных В-лимфоцитов:

интерлейкин-2

интерлейкин-4

-интерлейкин-5

интерлейкин-6

Сигнал дифференциации пролиферированных В-лимфоцитов в плазматические клетки:

интерлейкин-2

интерлейкин-4

интерлейкин-5

-интерлейкин-6

Клетки, синтезирующие антитела:

Т-хелпер

Т-супрессор

Т-киллер

Т-эффектор ГЗТ

В-лимфоцит

-плазмоцит

Охарактеризуйте плазмоцит:

содержит BCR

содержит МНС-II

-синтезирует антитела

-короткоживущая клетка

Распознавание и презентация Т-независимого антигена проводится:

макрофагом

дендритной клеткой

-В-лимфоцитом

Т-лимфоцитом

В ходе иммунного ответа на Т-независимый антиген:

синтезируются только IgG

-синтезируются только IgМ

сначала синтезируются IgМ с последующим переключением на IgG

образуются клетки иммунологической памяти

-процессы процессинга и презентации антигена происходят в самом В-лимфоците

В ходе иммунного ответа на Т-зависимый антиген:

синтезируются только IgG

синтезируются только IgМ

-сначала синтезируются IgМ с последующим переключением на IgG

-образуются клетки иммунологической памяти

процессы процессинга и презентации антигена происходят в самом В-лимфоците

Какой механизм эффекторного действия антител преобладает в ходе иммунного ответа против гельминтов:

нейтрализация

опсонизация

активация комплемента

-антителозависимая клеточная цитотоксичность

К какой фракции сывороточных глобулинов относятся иммуноглобулины (антитела):

альфа-глобулины

бета-глобулины

-гамма-глобулины

На сколько классов классифицируются иммуноглобулины:

четыре

-пять

шесть

семь

иммуноглобулины не классифицируются на классы

Какие классы иммуноглобулинов содержат подклассы:

-IgG

-IgА

IgM

IgD

IgE

Какой класс иммуноглобулинов содержит четыре подкласса:

-IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

Какой класс иммуноглобулинов содержит два подкласса:

IgG

-IgА

IgM

IgD

IgE

Дополнительная полипептидная цепь в молекуле иммуноглобулинов, соединяющая мономеры иммуноглобулинов в единую полимерную молекулу:

-J-белок (полипептидная цепь)

S-белок (полипептидная цепь)

М-белок (полипептидная цепь)

Белок (дополнительная полипептидная цепь), который защищает IgAs от ферментативного расщепления в секретах слизистых оболочек:

J-белок (полипептидная цепь)

-S-белок (полипептидная цепь)

М-белок (полипептидная цепь)

Белок (дополнительная полипептидная цепь), который фиксирует рецепторный иммуноглобулин – в составе BCR – на мембране В-лимфоцита:

J-белок (полипептидная цепь)

S-белок (полипептидная цепь)

-М-белок (полипептидная цепь)

Одновалентные иммуноглобулины:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Двухвалентные иммуноглобулины:

-IgG

-IgА

IgM

-IgD

IgE

IgAs

Четырёхвалентные иммуноглобулины:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

-IgAs

Десятивалентные иммуноглобулины:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

Какой иммуноглобулин проникает через плацентарный барьер:

-IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

IgAs

Основная функция – осуществление эффекторного звена вторичного иммунного ответа:

-IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

IgAs

Основная функция – обеспечение местного иммунитета слизистых оболочек:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

-IgAs

Иммуноглобулин первичного иммунного ответа:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

Формирует Ag-распознающий рецептор зрелых В-лимфоцитов:

IgG

IgА

IgM

-IgD

IgE

IgAs

Иммуноглобулин анафилактической реакции:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Мономеры:

-IgG

-IgА

IgM

-IgD

-IgE

IgAs

Пентамер:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

Димер:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

-IgAs

Полные антитела:

-IgG

-IgА

-IgM

-IgD

IgE

-IgAs

Неполные антитела:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Вызывают видимые двухкомпонентные серологические реакции:

-IgG

-IgА

-IgM

-IgD

IgE

-IgAs

Не вызывают видимых реакций агглютинации и преципитации:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Блокирующие антитела:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Прочность связи конкретной пары паратоп/эпитоп:

-аффинность

авидность

Прочность связи молекулы антитела в целом с молекулой антигена в целом:

аффинность

-авидность

Наибольшей аффинностью обладают:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

IgAs

-моноклональные антитела

Наибольшей авидностью обладают:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

моноклональные антитела

Антитела, продуцируемые одним клоном плазмоцитов:

-моноклональные антитела

нормальные антитела

неполные антитела

блокирующие антитела

Антитела, продуцируемые гибридомами:

-моноклональные антитела

нормальные антитела

неполные антитела

блокирующие антитела

Для выявления иммуноглобулинов какого класса используется реакция Кумбса:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

моноклональных антител

иммуноглобулинов любого класса

Этим термином обозначают антитела, которые не только связывают антиген, но и могут катализировать некоторые биохимические реакции:

-абзимы

реагины

гибридомы

неполные антитела

полные антитела

Первая фаза антителообразования:

-латентная

логарифмическая

стационарная

фаза снижения

Вторая фаза антителообразования:

латентная

-логарифмическая

стационарная

фаза снижения

Третья фаза антителообразования:

латентная

логарифмическая

-стационарная

фаза снижения

Четвёртая фаза антителообразования:

латентная

логарифмическая

стационарная

-фаза снижения

Индуктивная фаза антителообразования:

-латентная

логарифмическая

стационарная

фаза снижения

Длительность латентной фазы антителообразования при первичном иммунном ответе:

-около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность латентной фазы антителообразования при вторичном иммунном ответе:

около 5 суток

-примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность логарифмической фазы антителообразования при первичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

-примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность логарифмической фазы антителообразования при вторичном иммунном ответе:

-около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность стационарной фазы антителообразования при первичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

-примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность стационарной фазы антителообразования при вторичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

-месяцы

до полугода

годы

Длительность фазы снижения антителообразования при первичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

-до полугода

годы

Длительность фазы снижения антителообразования при вторичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

-годы

В какую из фаз антителообразования происходит презентация антигена, активация, пролиферация и дифференциация соответствующих клонов иммунокомпетентных клеток, синтез сначала IgM с последующим переключением на синтез IgG (при вторичном иммунном ответе – сразу синтезируется IgG):

-латентная

логарифмическая

стационарная

фаза снижения

В какую из фаз антителообразования происходит нарастание титра синтезируемых антител (при вторичном иммунном ответе – более интенсивное и до более высоких титров):

латентная

-логарифмическая

стационарная

фаза снижения

В какую из фаз антителообразования достигается максимальный уровень специфических антител:

латентная

логарифмическая

-стационарная

фаза снижения

В какую из фаз антителообразования происходит постепенное снижение титра специфических антител:

латентная

логарифмическая

стационарная

-фаза снижения

Диагностические сыворотки (например, для реакции агглютинации на стекле):

-кроличьи

бычьи

человеческие

лошадиные

крысиные

39.3. Первичный и вторичный иммунный ответ

В зависимости от характера контакта с антигеном (а точнее – наличием в организме клеток иммунологической памяти, несущих рецептор к причинному антигену) различают первичный и вторичный иммунный ответ (Рис. 39.3-1).

Рис. Рис. 39.3-1. Общая схема гуморального и клеточного иммунного ответа на Т-зависимые и Т-независимые антигены

А. Первичный иммунный ответ развивается после первого контекта с антигеном. Для него характерны следующие особенности.

– Наличие латентного периода (2-3 дня после первого контакта с антигеном). Это связано с отсутствием лимфоцитов памяти. Все клоны лимфоцитов находятся в фазе покоя G0. При поступлении в организм антигена вначале синтезируются IgM (антитела выявляются через 2-3 суток), а затем – IgG (пик приходится на 10-14 сутки, причем эти антитела могут сохранятся в низком титре в течение всей жизни). Отмечается также небольшое увеличение уровней IgA, IgE и IgD. Образуются комплексы антиген-антитело.

– Уже с третьих суток появляются иммунные Т-лимфоциты.

– Первичный иммунный ответ затихает через 2-3 недели после стимуляции антигеном.

– Появляются лимфоциты памяти и может долго поддерживаться следовой уровень IgG.

Б. Вторичный иммунный ответ развивается после повторного контакта с тем же антигеном и имеет следующие особенности.

– В организме уже имеются долгоживущие клоны антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов памяти, ответственных за «память» об антигене и способных к рециркуляции, они находятся не в покое, а в фазе G1.

– Стимуляция синтеза антител и иммунных Т-лимфоцитов наступает через 1-3 дня.

– Т-клетки памяти быстро превращаются в эффекторные.

– Количество антител сразу резко увеличивается, причем синтезируются иммуноглобулины высокой специфичности – IgG.

– Чем больше контактов с антигенами имело место в данном организме, тем выше будет концентрация и специфичность (аффинность) антител.

39.4. Кооперативный механизм действия и регуляции иммунной системы

Кооперативные механизм действия и регуляции иммунной системы осуществляется на двух уровнях.

А. Внутри иммунной системы кооперация и регуляция осуществляется посредством межклеточных взаимоотношений иммуноцитов и «нанятых» иммунной системой клеток, в том числе с помощью цитокинов.

Б. Межсистемная кооперация и регуляция иммунной системы осуществляется на уровне организма с вовлечением центральной нервной и эндокринной систем (Рис. 39.4-1), алгоритм которой впервые предложил П.Ф.Здродовский (гипоталамоадреналовая теория иммунитета Здродовского). О вовлечении системы иммунитета в месистемную кооперацию на организменном уровне свидетельствуют следующие факты.

Рис. 39.4-1. Функциональная связь иммунной, эндокринной и нервной систем

14Г. Тестовые вопросы по теме занятия

В ходе иммунного ответа антигенпрезентирующая клетка представляет антиген:

-нулевому (наивному) Т-хелперу

Т-хелперу первого типа

Т-хелперу второго типа

Т-киллеру

Т-супрессору

Восприняв сигнал от антигенпрезентирующей клетки, нулевой (наивный) Т-хелпер додифференцируется в:

Т-хелпер первого типа

-Т-хелпер второго типа

Т-киллер

Т-супрессор

Т-эффектор ГЗТ

Синтез каких цитокинов характерен для Т-хелпера второго типа:

интерлейкин-2

-интерлейкин-4

-интерлейкин-5

-интерлейкин-6

Сигнал активации В-лимфоцитов:

интерлейкин-2

-интерлейкин-4

интерлейкин-5

интерлейкин-6

Сигнал пролиферации активированных В-лимфоцитов:

интерлейкин-2

интерлейкин-4

-интерлейкин-5

интерлейкин-6

Сигнал дифференциации пролиферированных В-лимфоцитов в плазматические клетки:

интерлейкин-2

интерлейкин-4

интерлейкин-5

-интерлейкин-6

Клетки, синтезирующие антитела:

Т-хелпер

Т-супрессор

Т-киллер

Т-эффектор ГЗТ

В-лимфоцит

-плазмоцит

Охарактеризуйте плазмоцит:

содержит BCR

содержит МНС-II

-синтезирует антитела

-короткоживущая клетка

Распознавание и презентация Т-независимого антигена проводится:

макрофагом

дендритной клеткой

-В-лимфоцитом

Т-лимфоцитом

В ходе иммунного ответа на Т-независимый антиген:

синтезируются только IgG

-синтезируются только IgМ

сначала синтезируются IgМ с последующим переключением на IgG

образуются клетки иммунологической памяти

-процессы процессинга и презентации антигена происходят в самом В-лимфоците

В ходе иммунного ответа на Т-зависимый антиген:

синтезируются только IgG

синтезируются только IgМ

-сначала синтезируются IgМ с последующим переключением на IgG

-образуются клетки иммунологической памяти

процессы процессинга и презентации антигена происходят в самом В-лимфоците

Какой механизм эффекторного действия антител преобладает в ходе иммунного ответа против гельминтов:

нейтрализация

опсонизация

активация комплемента

-антителозависимая клеточная цитотоксичность

К какой фракции сывороточных глобулинов относятся иммуноглобулины (антитела):

альфа-глобулины

бета-глобулины

-гамма-глобулины

На сколько классов классифицируются иммуноглобулины:

четыре

-пять

шесть

семь

иммуноглобулины не классифицируются на классы

Какие классы иммуноглобулинов содержат подклассы:

-IgG

-IgА

IgM

IgD

IgE

Какой класс иммуноглобулинов содержит четыре подкласса:

-IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

Какой класс иммуноглобулинов содержит два подкласса:

IgG

-IgА

IgM

IgD

IgE

Дополнительная полипептидная цепь в молекуле иммуноглобулинов, соединяющая мономеры иммуноглобулинов в единую полимерную молекулу:

-J-белок (полипептидная цепь)

S-белок (полипептидная цепь)

М-белок (полипептидная цепь)

Белок (дополнительная полипептидная цепь), который защищает IgAs от ферментативного расщепления в секретах слизистых оболочек:

J-белок (полипептидная цепь)

-S-белок (полипептидная цепь)

М-белок (полипептидная цепь)

Белок (дополнительная полипептидная цепь), который фиксирует рецепторный иммуноглобулин – в составе BCR – на мембране В-лимфоцита:

J-белок (полипептидная цепь)

S-белок (полипептидная цепь)

-М-белок (полипептидная цепь)

Одновалентные иммуноглобулины:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Двухвалентные иммуноглобулины:

-IgG

-IgА

IgM

-IgD

IgE

IgAs

Четырёхвалентные иммуноглобулины:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

-IgAs

Десятивалентные иммуноглобулины:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

Какой иммуноглобулин проникает через плацентарный барьер:

-IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

IgAs

Основная функция – осуществление эффекторного звена вторичного иммунного ответа:

-IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

IgAs

Основная функция – обеспечение местного иммунитета слизистых оболочек:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

-IgAs

Иммуноглобулин первичного иммунного ответа:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

Формирует Ag-распознающий рецептор зрелых В-лимфоцитов:

IgG

IgА

IgM

-IgD

IgE

IgAs

Иммуноглобулин анафилактической реакции:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Мономеры:

-IgG

-IgА

IgM

-IgD

-IgE

IgAs

Пентамер:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

Димер:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

-IgAs

Полные антитела:

-IgG

-IgА

-IgM

-IgD

IgE

-IgAs

Неполные антитела:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Вызывают видимые двухкомпонентные серологические реакции:

-IgG

-IgА

-IgM

-IgD

IgE

-IgAs

Не вызывают видимых реакций агглютинации и преципитации:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Блокирующие антитела:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

Прочность связи конкретной пары паратоп/эпитоп:

-аффинность

авидность

Прочность связи молекулы антитела в целом с молекулой антигена в целом:

аффинность

-авидность

Наибольшей аффинностью обладают:

IgG

IgА

IgM

IgD

IgE

IgAs

-моноклональные антитела

Наибольшей авидностью обладают:

IgG

IgА

-IgM

IgD

IgE

IgAs

моноклональные антитела

Антитела, продуцируемые одним клоном плазмоцитов:

-моноклональные антитела

нормальные антитела

неполные антитела

блокирующие антитела

Антитела, продуцируемые гибридомами:

-моноклональные антитела

нормальные антитела

неполные антитела

блокирующие антитела

Для выявления иммуноглобулинов какого класса используется реакция Кумбса:

IgG

IgА

IgM

IgD

-IgE

IgAs

моноклональных антител

иммуноглобулинов любого класса

Этим термином обозначают антитела, которые не только связывают антиген, но и могут катализировать некоторые биохимические реакции:

-абзимы

реагины

гибридомы

неполные антитела

полные антитела

Первая фаза антителообразования:

-латентная

логарифмическая

стационарная

фаза снижения

Вторая фаза антителообразования:

латентная

-логарифмическая

стационарная

фаза снижения

Третья фаза антителообразования:

латентная

логарифмическая

-стационарная

фаза снижения

Четвёртая фаза антителообразования:

латентная

логарифмическая

стационарная

-фаза снижения

Индуктивная фаза антителообразования:

-латентная

логарифмическая

стационарная

фаза снижения

Длительность латентной фазы антителообразования при первичном иммунном ответе:

-около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность латентной фазы антителообразования при вторичном иммунном ответе:

около 5 суток

-примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность логарифмической фазы антителообразования при первичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

-примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность логарифмической фазы антителообразования при вторичном иммунном ответе:

-около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность стационарной фазы антителообразования при первичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

-примерно 20 дней

месяцы

до полугода

годы

Длительность стационарной фазы антителообразования при вторичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

-месяцы

до полугода

годы

Длительность фазы снижения антителообразования при первичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

-до полугода

годы

Длительность фазы снижения антителообразования при вторичном иммунном ответе:

около 5 суток

примерно сутки

примерно 10 дней

примерно 20 дней

месяцы

до полугода

-годы

В какую из фаз антителообразования происходит презентация антигена, активация, пролиферация и дифференциация соответствующих клонов иммунокомпетентных клеток, синтез сначала IgM с последующим переключением на синтез IgG (при вторичном иммунном ответе – сразу синтезируется IgG):

-латентная

логарифмическая

стационарная

фаза снижения

В какую из фаз антителообразования происходит нарастание титра синтезируемых антител (при вторичном иммунном ответе – более интенсивное и до более высоких титров):

латентная

-логарифмическая

стационарная

фаза снижения

В какую из фаз антителообразования достигается максимальный уровень специфических антител:

латентная

логарифмическая

-стационарная

фаза снижения

В какую из фаз антителообразования происходит постепенное снижение титра специфических антител:

латентная

логарифмическая

стационарная

-фаза снижения

Диагностические сыворотки (например, для реакции агглютинации на стекле):

-кроличьи

бычьи

человеческие

лошадиные

крысиные

Антитела первичный — Справочник химика 21

    Прежде чем начнется синтез антител, первичный транскрипт РНК должен освободиться от интронов путем сплайсинга. В начале и в конце каждо- [c.144]

    Т-зависимые зоны В-зависимые зоны Ни Т-, ни В-зоны Движение (хоминг) из крови в эксудат из крови в Т-зависимые области с афферентной лимфой в Т-зависимые области Функция антиген-презентации при синтезе антител первичном синтезе антител вторичном клеточном ответе Судьба чужеродного антигена при захвате элиминация [c.138]

    Как было установлено, главным образом работами Р. Портера в Англии и Г. Эдельмана в США, молекулы антител, присутствующих в плазме крови человека, состоят из четырех полипептидных цепей, удерживаемых вместе 5—З-связями цистина (рис. 15.18). Каждая из двух длинных цепей содержит по 446 аминокислотных остатков, а каждая из коротких — по 214 остатков. Полностью определена первичная [c.448]

    При сближении антитела (АЬ) и антигена (А ) первичная связывающая сила является ионной (дальнее взаимодействие), действующей на расстояниях свыше 10 нм. Медленное удаление гидратационной воды приводит к образованию водородных связей на расстояниях 0,5-0,15 нм, силы Ван-дер-Ваальса (ближнее взаимодействие) между диполями на соседних атомах становятся более значимыми и связь упрочняется. Связывание можно описать с помощью равновесия  [c.566]

    Несомненно, что и биологические функции, и механические свойства полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров в большой мере определяются конформацией макромолекулы и распределением в ней реакционноспособных групп. Все эти факторы зависят, в конечном счете, от первичной структуры полимера. Поэтому понимание факторов, определяющих специфичность биологической функции углеводсодержащих соединений и технические свойства полисахаридов, зависит в первую очередь от развития теоретических представлений о связи между строением, конформацией, реакционной способностью и физико-химическими свойствами полисахаридов и смешанных биополимеров, содержащих олиго- и полисахаридные цепи. Установление этих связей является предпосылкой для осуществления направленного синтеза соответствующих физиологически активных веществ и направленной модификации полисахаридов для получения материалов с заранее заданными свойствами. Поэтому исключительно важной задачей является разработка надежных методов установления первичной структуры полисахаридных цепей, требующих минимальной затраты времени и минимального количества материала. Не менее важны эффективные подходы к точной характеристике конформаций полисахаридной цепи в целом и отдельных ее участков, вплоть до моносахаридных звеньев. Очевидна также необходимость изучения реакционной способности полисахаридной цепи, ее отдельных звеньев и различных функциональных групп, что позволит понять механизм взаимодействия углеводсодержащих биополимеров с их партнерами в биологических системах (например, с антителами при иммунологических реакциях), наметить целесообразный путь модификации природного полимера для придания ему нужных свойств и т. д. [c.625]

    Наиболее выпукло способность к узнаванию выражена у белков иммунной системы — уже упоминавшихся в 1.4 иммуноглобулинов, или антител. Иммуноглобулины определенной специфичности начинают активно вырабатываться организмом в ответ на появление чужеродного антигена и обладают способностью избирательно связывать именно этот антиген. Если в роли антигена выступает большая молекула, например молекула белка, то антитело опознает не всю молекулу, а некоторый ее участок, называемый антигенной детерминантой. Белковые молекулы обычно имеют серию антигенных детерминант, и уже по этой причине в ответ на появление в организме чужеродного белка вырабатывается целый набор антител, направленных на разные детерминанты. Более того, к каждой детерминанте вырабатывается, как правило, несколько различных иммуноглобулинов. Поэтому даже иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену, представляют собой не индивидуальные белки, а смесь большого числа сходным образом построенных молекул. А так как организм непрерывно встречается с разнообразными антигенами, то фракция иммуноглобулинов сыворотки крови представляет собой смесь огромного числа различных антител, причем содержание каждого из них, как правило, очень мало. Трудность выделения индивидуальных иммуноглобулинов долгое время была препятствием для их биохимического исследования, в том числе для установления их первичной структуры. [c.38]

    Как видно из рис. 30.5, даже незрелые В-клетки способны образовывать антитела, поэтому организм должен обезопасить себя от возможных аутоиммунных реакций, при которых антитела связывают эндогенные макромолекулы. Механизм удаления таких аномальных В-клеток заключается в следующем. В процессе первичного созревания клетка синтезирует антитела, которые фиксируются на поверхности ее мембраны. Если какое-либо эндогенное вещество прореагирует с ними, то клетка погибает или удаляется из пула В-лимфоцитов. Таким образом, в кровоток вьщеляются В-клетки, которые взаимодействуют только с чужеродными веществами или антигенами. Если такая клетка встретит антиген, она активируется, но еще не превращается в дифференцированную плазматическую клетку. Существует несколько вариантов активации В-клеток. [c.482]

    Диагностическое значение имеет обнаружение агглютининов в титре 1 100 и выше. Рекомендуется исследовать парные сыворотки (второй раз спустя 7—10 дней после первичного исследования). Увеличение титра антител в 4 и более раз имеет высокую диагностическую ценность. [c.124]

    Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиге