с помощью, и резус фактора, методом

Определение группы крови по стандартным сывороткам используется часто (по сравнению с другими методиками). В основе данной техники — содержащиеся в крови агглютинины и агглютиногены в различных комбинациях.

Соединение одноименных агглютиногена и агглютинина сопровождается реакцией агглютинации (однородное пятно распадается на многочисленные мелкие пятна, состоящие из эритроцитов, склеившихся между собой).

Суть метода

При оказании медицинской помощи не всегда удается быстро остановить кровотечение, для переливания требуется определение группы крови, резус-фактора.

Существуют 2 эритроцитных антигена (агглютиногены А и В) и 2 антитела (а и b). Различные комбинации антигенов и антител образуют 4 группы крови.

Данный способ имеет преимущества, т. к. позволяет свести к одному многочисленные измерения.

Методика определения показателей

Определение групп крови по стандартным сывороткам проводится с использованием реактивов, содержащих агглютинины разных групп, вступающих в реакцию с агглютиногенами, находящимися на поверхности эритроцитов.

Чтобы выявить группу крови, достаточно воспользоваться стандартными сыворотками лишь II и III групп. Однако для исключения возможных ошибок с целью дополнительного контроля используют и остальные (I и IV групп).

Изготовление сыворотки

Стандартные сыворотки для определения группы крови получают из донорской крови. С этой целью используют специальную систему: выделяют плазму вместе с находящимися в ней антителами, затем ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия.

Помещают 1 мл раствора NaCl 0,9% в пробирку, добавляют плазму (1 мл), взбалтывают состав. Берут 1 мл полученной смеси, переносят в другую пробирку с изотоническим раствором.

Манипуляцию повторяют, пока не получат разведение смеси в пропорции 1:256. Другие разведения не используют, чтобы исключить возникновение ошибки.

Для одного исследования группы крови с помощью стандартных сывороток их требуется 3 (2 серий для каждой группы), отличающихся по цвету:

• I (0) — прозрачная жидкость, флакон снабжен белой этикеткой;
• II (А) — жидкость голубая, флакон с 2 полосами синего цвета;
• III (В) — бледно-розовая жидкость, флакон с 3 розовыми полосками;
• IV(АВ) — желтая жидкость, на этикетке флакона 4 желтые полоски.

На этикетках указаны:

• титр;
• срок годности;
• дата выпуска;
• серийный номер.
• данные об изготовителе.

Проведение исследования

Температура в помещении должна быть в пределах +15…+ 25°С, требуется хорошее освещение.

Используют специальный планшет, имеющий области с пометками. На него наносят каждую сыворотку (берут 2 образца, 1 из них — контрольный, 2 — для диагностики).

Затем рядом с каждой каплей сыворотки размещают каплю крови, смешивая с каждым в отдельности реагирующим раствором. Спустя несколько минут (5-6) анализируют полученные данные:

• если происходит реакция агглютинации — сывороточный тест считается положительным;
• при отсутствии агглютинации тест отрицательный.

Результаты исследования

В случае положительного результата эритроциты склеиваются (в реагирующем растворе образуются красные сгустки).

Если цвет раствора не изменился, реакция считается отрицательной. Есть закономерности, зависящие от комбинаций отрицательных и положительных реакций, происходящих в растворах:

• I(0), если ни в одном образце нет положительной реакции;
• II (А), если в образце II (А) состояние не изменилось, а в 2 остальных оказалась положительная реакция;
• III(В), если только в образце III(В) реакция оказалась отрицательной;
• IV(АВ), если в каждом из 3 образцов реакция оказалась положительной.

Появление других комбинаций связано с погрешностями, возникающими при исследовании.

Использование старых реактивов или неправильное проведение анализа может сопровождаться слабой реакцией. В таких случаях с целью уточнения необходимо сделать тесты с использованием других методик.

Вконтакте

Facebook

Twitter

Google+

Одноклассники

Определение группы крови стандартными сыворотками пробирочным способом

Описанный капельный метод при соблюдении всех правил и предосторожностей дает в опытных руках точные результаты и, будучи наиболее простым, является и наиболее распространенным. Однако при несоблюдении правил он легко может повести к ошибкам, почему некоторые исследователи считают его недостаточным и рекомендуют определение группы в пробирках. В некоторых лабораториях пробирочный метод введен в качестве основного.

Пробирки употребляются так называемые агглютинационные — диаметром 6-8 мм, высотой 8-10 см. Для производства реакции в штатив ставят рядом три пробирки. На каждой отмечается номер исследования и группа стандартной сыворотки, для которой пробирка предназначена. Затем в первую пробирку наливают 0,1 см3 (2 капли) сыворотки 0, во вторую пробирку — столько же сыворотки А и в третью — сыворотку В. Затем в каждую пробирку наливают по 0,2 см3 (4 капли) предварительно приготовленной 2% взвеси испытуемых эритроцитов. Каждую пробирку сильно встряхивают и через 3-5 минут подвергают центрифугированию. Последнее не обязательно, результаты реакции можно видеть и после простого стояния пробирок, но это требует больше времени.

Если производят центрифугирование, то оно должно продолжаться не менее двух минут при 2 000 оборотов в минуту. При наличии в центрифуге только малых гильз агглютинационную пробирку помещают в центрифужную, в которую перед тем налито немного воды, заполняющей свободное пространство и придающей малой пробирке необходимую устойчивость. Если же центрифуга имеет широкие гильзы, в каждую такую гильзу непосредственно можно поместить 4-6 агглютинационных пробирок. Понятно, что при таком способе пробирки должны быть хорошо отмечены во избежание путаницы в дальнейшем. Если центрифугирования не производят, пробирки оставляют стоять два часа. После центрифугирования или стояния пробирки осторожно встряхивают, тогда сразу бывает видно, образовались ли кучки или аритроциты распределились равномерно, образуя мутную взвесь, как вначале. Наличие кучек указывает на положительную реакцию, равномерная взвесь — на отрицательную. При сильной агглютинации, нередко проявляющейся вполне ясно до центрифугирования, эритроциты скучиваются на дне в один большой комок, который при умеренном потряхивании всплывает в прозрачной жидкости. При сильном встряхивании этот комок распадается на несколько более мелких комочков. При менее сильных степенях агглютинации в пробирке видны различной величины кучки, из которых более крупные после потряхивания быстро опускаются на дно пробирки, а сама сыворотка светлеет. Во всяком случае, положительный результат резко отличен от результата отрицательного, при котором после несильного встряхивания смесь делается мутной и следов кучек не видно.

Группу определяют по той же табл., которая применяется для капельного способа. Несоответствие результатов, указанное в последующей таблице, также указывает на недочеты реакции и на необходимость провести реакцию вновь.

Дополнительное определение группы крови стандартными эритроцитами

Для этого применяют те же самые методы, с той лишь разницей, что на стекло или в пробирку помещают не стандартные сыворотки, а одну и ту же сыворотку испытуемой крови — 3 капли на стекло или по 0,2 см3 в каждую из трех пробирок. К первой порции сыворотки прибавляют стандартные эритроциты группы О, ко второй — эритроциты группы А, к третьей — эритроциты группы В. Все эритроциты прибавляют в описанном выше виде и количестве, т. е. при капельном способе — по 4-5 мм

3 неразведенной крови, при методе в пробирках — по 0,2 см3 2% взвеси. Наблюдение за реакцией производят совершенно так же, как описано выше.

Наличие признаков положительной реакции с эритроцитами группы 0 имеет важное значение: оно может указывать на панагглютинирующую способность сыворотки, но скорее указывает на неправильность выбора эритроцитов или на допущенную ошибку. При малейших признаках агглютинации с эритроцитами группы О всю реакцию надо повторить сначала с эритроцитами других лиц и точно установить причины образования кучек.

При оценке этой пробы нельзя забывать о возможности отсутствия изоагглютининов или об очень слабом титре их, что может служить источником ошибок. Поэтому определение группы крови только по одной сыворотке испытуемой крови никогда не может быть достаточным для выявления групповой характеристики.

Если нужно определить группу по сыворотке (или плазме) человека, то кровь можно взять из места укола в количестве 1 см³ в пробирку, где ее оставляют свертываться. При таком небольшом количестве кровь свертывается через 1-2 часа.

Центрифугирование облегчает дальнейшее отсасывание сыворотки, которую пипеткой переносят прямо на стекло, тарелку или пробирку для реакции. Эритроциты для реакции можно брать из оставшегося свертка другой пипеткой.

Если взять кровь в смеси с цитратно-солевым раствором, то слой плазмы, образовавшийся после отстаивания или центрифугирования, вполне пригоден для всех реакций.

Определение группы крови и резус фактора

/ 29

29 Методы определения групп крови и резус-фактора. Профилактика возможных ошибок

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток. В лунки планшета для определения групп крови последовательно наносят пипетками по одной крупной капле стандартной сыворотки групп 0(1), А(П), В(Ш) двух различных серий каждой группы. Затем наносят в каждую лупку по капле исследуемой крови, в 5 — 10 раз меньшую сыворотки. Сухими стеклянными палочками или путем покачивания планшета смешивают стандартные сыворотки и исследуемую кровь. Через 5 минут оценивают результат (табл. 2).

Таблица 2

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток

Группа исследуемой крови	Стандартные сыворотки
	0(I)	А(II)	В (III)
0(I)	—	—	—
А(II)	+	—	+
В(III)	+	+	—
AB(IV)	+	+	+

Определение групп крови по стандартным эритроцитам. В лунки планшета наносят большие капли плазмы исследуемой крови. Рядом с каждой каплей плазмы последовательно наносят по небольшой капле стандартных эритроцитов групп 0(1), А(II), В(III). Капли перемешивают покачиванием планшета. Через 5 минут к каждой капле смеси добавляют по 1 капле физиологического раствора и учитывают результат.

Таблица 3

Определение групп крови с помощью стандартных эритроцитов

Группа исследуемой крови	Стандартные эритроциты
	0(I)	А(II)	В (III)
0(I)	—	+	+
А(II)	—	—	+
В(III)	—	+	—
AB(IV)	—	—	—

Определение резус-фактора. На дно сухой пробирки наносят 1 большую каплю универсального реагента анти-резус, затем добавляют такую же каплю исследуемой крови. После встряхивания пробирки производят перемешивание сыворотки анти-резус и крови в течение 5 минут по стенкам пробирки, после чего добавляют 5 — 7 мл физиологического раствора. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

Определение групп крови с помощью цоликлонов. Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.

Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Цоликлоны изготовляются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител.

Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5 — 10 мл. Цоликлон анти-А — желтого цвета, анти-В — синего, анти-АВ — бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия.

Техника определения групп крови. Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на пластине или планшете, определение производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15 — 25 X.

1. Наносят на пластину или планшет индивидуальными пипетками цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.

2. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 — 0,03 мл).

3. Смешивают кровь с реагентом, покачивая планшет.

4. Наблюдают за ходом реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3 — 5 секунд,

Определение групповой принадлежности крови с использованием антител

Определение группы крови можно произвести с помощью моноклональных антител (МКА). Для определения агглютиногенов эритроцитов используют стандартные реагенты цоликлоны анти-А и анти-В. Получают моноклональные антитела с применением гибридомной битехнологии. Гибридома – это клеточный гибрид, возникший в результате слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих “родителей”: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту. Цоликлоны анти-А и анти-В продуцируются двумя различными гибридомами. Они предназначены для определения группы крови системы АВО человека взамен стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Цоликлоны анти-А (красного цвета) и анти-В (синего цвета) выпускаются как в нативной, так и в лиофилизированной форме в ампулах по 20,50,100,200 доз с растворителем, приложенным к каждой ампуле по 2,5, 10,20 мл соответственно. Лиофилизированный порошок разводят изотоническим раствором хлористого натрия непосредственно перед исследованием. Для каждого определения группы крови применяют по одной серии реагента анти-А и анти-В.

Материальное оснащение: цоликлоны анти-А и анти-В, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник.

Методика выполнения:

1. Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

2. Убедиться в пригодности цоликлонов, донорской крови.

3. На тарелке написать Ф. И. О. донора и реципиента.

4. Вскрыть ампулы с цоликлонами, растворителями, смешать все с помощью отдельных шприцев, разлить цоликлоны во флаконы с пипеткой (анти-А – красный, анти-В – синий).

5. Взять кровь реципиента и донора.

6. В две лунки под соответствующими надписями: анти-А или анти-В нанести по 1 капле (0,1мл) цоликлонов: в первую – цоликлон анти-А, во вторую – цоликлон анти-В.

7. Отдельным концом стеклянной палочки или отдельной пипеткой для каждой лунки перенести каплю крови в 10 раз меньше капли цоликлона с предметного стекла в лунку и смешать с каплей цоликлона до гомогенного пятна.

8. Блюдце осторожно покачивать в течение 2,5 мин.

9. Оценить результат пробы без добавления изотонического раствора натрия хлорида.

Оценка результатов:

• При отсутствии агглютинации с двумя цоликлонаи группа крови 0(I) – первая.

• При наличии агглютинации с цоликлоном анти-А группа крови А(II) – вторая.

• При наличии агглютинации с цоликлоном анти-В группа крови В(III) – третья.

• При наличии агглютинации с двумя цоликлонами группа крови АВ(IV) – четвертая.

ОШИБКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППОВОЙ

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

Ошибки при определении групповой принадлежности крови могут быть обусловлены тремя видами причин:

• техническими;

• неполноценностью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов;

• особенностями испытуемой крови.

Технические причины:

• нарушение порядка расположения сывороток на планшете;

• нарушение соотношения сыворотки и эритроцитов;

• несоблюдение внешних условий (плохая освещенность, изменение температуры окружающей среды)

• несоблюдение положенного для реакции агглютинации времени

• применение загрязненных кровью планшетов, пипеток, предметных стекол;

• неправильная запись исследуемой крови;

Применение неполноценных стандартных сывороток и

стандартных эритроцитов:

• слабые стандартные сыворотки с титром ниже 1:32 или истекшим сроком годности могут вызывать позднюю и слабую агглютинацию;

• применение негодных стандартных сывороток или эритроцитов, нестерильно приготовленных и недостаточно законсервированных, ведет к возникновению неспецифической, «бактериальной» агглютинации.

Особенности испытуемой крови

• наличие в крови слабого агглютиногена А_2,.

• кровь обладает свойством «панагглютинации» или «аутоагглютинации», т. е. дает неспецифическую агглютинацию со всеми сыворотками и даже со своей собственной сывороткой. Для устранения панагглютинации планшет помещают в термостат при температуре 37° на 5 минут, после чего панагглютинация исчезает, а истинная остается.

ТАКТИКА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППЫ КРОВИ

Непосредственно в отделении группа крови определяется врачом по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам или с помощью цоликлонов, после этого в серологической лаборатории производится проверка перекрестным методом. Если результаты совпадают, то группа крови считается определенной. В случае расхождения результатов, производятся повторные исследования.

В экстренных ситуациях можно ограничится реакцией с изогемагглютинирующими сыворотками или цоликлонами, но при возможности следует использовать перекрестный метод.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ФАКТОРА

Для определения резус-фактора применяют несколько методик. При этом используют специальные сыворотки, содержащие антирезус-антитела, которые получают из крови резус-отрицательных людей, иммунизированных резус-фактором. Сыворотка антирезус должна принадлежать к той же группе крови по системе АВО, какая имеется у больного.

Метод агглютинации в солевой среде.

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2 % взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37˚С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод определения резус-фактора в пробирках с применением желатина. Реакцию проводят в центрифужных пробирках, в которые помещают равные объемы эритроцитов, сыворотки антирезус и 10 % раствора желатина. После встряхивания пробирки помещают в водяную баню при температуре +46-48˚С на 5 минут, после чего добавляют 5-8 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат реакции по наличию агглютинатов, видимых невооруженным глазом.

Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Наиболее чувствительная реакция для выявления неполных антител к ауто — и изоантигенам эритроцитов. Её применяют при возникновении трудностей в определении резус принадлежности крови, связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на применении антиглобулиновой сыворотки (АГС).

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37˚С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь – резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител (МКА) и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови. За реакцией наблюдают в течение 2,5 мин. При смешивании анти-D-МКА с образцами резус-положительных эритроцитов отмечается быстро наступающая лепестковая агглютинация. Если кровь резус-отрицательная – агглютинация отсутствует.

Экспресс-методы определения резус-фактора. Эти методы удобны для практических врачей в экстренных случаях.

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

Для исследования может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед исследованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента. Представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), содержащую 33 % раствор полиглюкина. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают по ее внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса “антиген-антитело” и четкой агглютинации наблюдать следует не менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путем одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови, отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Экспресс-метод определения Rh-фатора на плоскости без подогрева.

На белой пластинке со смачиваемой поверхностью пишут фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. На левом краю пластинки делают надпись “сыворотка-антирезус”, на правом — “контрольная сыворотка”. Последней служит разведенная альбумином сыворотка группы АВ(IV), не содержащая антител анти-резус. Соответственно надписям на пластинке помещают по 1-2 капли (0,05-0,1 мл) реактива анти-резус и контрольной сыворотки. К обеим каплям добавляют исследуемые эритроциты. Кровь размешивают с реактивом сухой стеклянной палочкой, размазывая на пластинке до образования капли диаметром 1,5 см. пластинку слега покачивают. Через 3-4 минуты для снятия возможной неспецифической агглютинации к каждой капле добавляют 5-6 капель физиологического раствора. Затем пластинку покачивают в течение 5 минут.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации невооруженным глазом.

Наличие хорошо выраженной агглютинации в капле слева указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови, отсутствие агглютинации в этой капле (гомогенная окраска) говорит о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови (Rh-). Результат считается истинным лишь при отсутствии признаков агглютинации в правой (контрольной) капле.