Методы определения содержания гемоглобина в крови: особенности диагностика

Методы определения содержания гемоглобина в крови разнятся между собой. Их особенности зависят от реактива, который используется в лабораториях, безопасности исследования, его точности и скорости. По результатам анализов проходит диагностика.

Клиническое значение определения гемоглобина

Гемоглобин образуется в эритроцитах. Делая вдох, кровяные тельца насыщаются кислородом. Через них белок по крови «доставляет» кислород в ткани, а затем, возвращаясь, углекислый газ попадает в легкие. Именно Hb в какой-то мере отвечает за такую важную функцию, как дыхание.

У взрослого человека значения гемоглобина зависят от пола. У женщин концентрация клеток ниже, так как их мышечная масса обычно меньше:

• 12-16 г/% или 120-160 г/л для мужчин;
• 11-14г/% или 110-140 г/л для женщин.

Эти показатели являются нормой. Их изменения в большую или меньшую сторон говорит о заболевании. Во время беременности или в пожилом возрасте показатели могут снижаться. Если понижение не связано с этими факторами, врачи часто диагностируют:

• железодефицитная, серповидно-клеточная анемия, которая приводит к уменьшению эритроцитов;
• недостаток фолиевой кислоты или витамина В12;
• болезни красного костного мозга.

Повышение гемоглобина тоже ведет за собой плохие последствия. Часто симптом связан с рядом проблем:

• злокачественные новообразования, болезни красного костного мозга;
• увеличение числа эритроцитов в связи с сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
• уменьшение плазмы крови.

Гемоглобин образуется в эритроцитах после того, как пропадает ядро или приобретения клетки зрелости. Селезенка утилизирует красные кровяные тельца и Hb. 1 клетка живет 4 месяца. После того, как она погибает, в крови образуется железо. Оно попадает в красный костный мозг. С его помощью появляются новые красные кровяные клетки.

Методы измерения гемоглобина в крови

Определение концентрации гемоглобина возможно с помощью нескольких методов. Hb измеряют еще и в моче, так как в мочевыводительной системе бывают кровотечения (как незначительные, так и обильные).

Различают несколько основных форм гемоглобина:

• оксигемоглобин;
• карбоксигемоглобин;
• дезоксигемоглобин.

Для анализа все формы Hb с помощью реактивов делают одинаковыми, чтобы их мог считать прибор. После применения определенной методики, используют полуавтоматический анализатор. С его помощью измеряют спектр длины волны молекулы гемоглобина.

Внимание! 

Такой анализатор исключает возможность реставрации ошибки врача в отчете необходимого значения. Аппарат также не способен увидеть и распознать различные нарушения в параметрах.

Ручной подсчет применяется с реактивом и биолоатериала. Такой способ не считает количество клеток, а определяет их присутствие в жидкости. Часто используют для анализа мочи.

Унифицированные методы определения гемоглобина

Исследование является точный, быстрым и используется в большинстве лабораторий. Для Hb подходит гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Метод основывается на определении точного числа клеток при помощи подсчета длины волны молекулы на специальном полуавтоматическом приборе.

Другой способ — гимехромный. Проводится также, однако для него используются более качественные реактивы, которые не вредят здоровью исследователя. Метод является более щадящим и применяется чаще первого.

Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови

Определить длину Hb сложно, так как он имеет много разных форм. Для упрощения процесса и более точных результатов его превращают в метгемоблогин. Делается это с помощью специальных химических веществ.

Чтобы правильно провести анализ необходим трансформирующий раствор, измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Длина волны гемоглобина составляет 540 м. В таком пределе аппарат определяет нужный показатель. Полученный результат высчитывается по формуле и переводится в значение граммы на литры.

Этот метод одобрен Комитетом здравоохранения из-за того, что он является максимально точным. Он имеет много положительных сторон:

• дешевизна реактивов, которая не требует от медицинского учреждения большого бюджета;
• простата в проведении: даже студент-лаборант сможет провести процедуру;
• скорость анализа;
• использование полуавтоматического анализатора, что исключает врачебную ошибку в подсчетах.

Несмотря на все плюсы, методику считают устарелой. У нее есть ряд серьезных недостатков:

• используемые вещества опасны для здоровья врача: при неправильной эксплуатации возможны поражение слизистых, кожи, дыхательных путей;
• наличие современных и полностью безопасных методов работы;
• врачебная ошибка возможна на этапе выбора дозировки реактивов.

Внимание! 

Метод проводится с использованием цианидных компонентов, что является опасным для здоровья врачей химикатом.

Гемиглобинцианидный способ исследования -точный анализ, который применялся раннее в каждом лаборатории. Сейчас же на смену ему пришли более современные методы.

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови

Здесь клетки Hb переводят в форму гемихрома (HbChr). Его легко удается подсчитать. По полученному числу врачи определяют концентрацию гемоглобина в биоматериале. Методика имеет множество плюсов:

• 2 варианта забора материала: капилярная крови или венозная;
• скорость исследования. Результаты будут готовы в день сдачи;
• безопасность для сотрудников, так как при анализе не используются опасные для здоровья вещества;
• полуавтоматический анализатор, который используют для подсчета количества клеток. Исключает врачебную ошибку;
• простота метода и цена используемых реактивов;
• высокая точность показателей, на основе которых врач делает выводы о состоянии пациента;
• использование небольшого количества крови. Если результаты показались сомнительными, анализ всегда можно сделать повторно.

Исследование полностью безопасно, но и у него есть ряд минусов. Делая выводы по поводу диагноза, специалист всегда должен помнить о недостатках методики:

• ошибки при сборе крови;
• неправильная концентрация реактивов или их неверное подготовление;
• размер клеток и их форму рассмотреть невозможно, так как фотометр лишь подсчитывает их количество.

Гемихромный метод используется врачами довольно часто для постановки диагноза больному. Он точен, безопасен и не затратен для больницы, поэтому очень популярен при анализе крови.

Цианидный метод исследования гемоглобина в крови

В капиллярную или венозную крови добавляется трансформирующий раствор. С его помощью образуется метгемоглобин.

Внимание! 

Цианид — опасное вещество, которое может навредить здоровью врачей-лаборантов. Поэтому метод является опасным и практически не проводится в медицинских учреждениях.

В пробирке смешивают 5 мл реагента и 20 мл биоматериала. В течение 10 минут происходит реакция. Жидкость выливают в специальный сосуд, через который фотоэлектроколориметр пропускает лучи. Он подсчитывает количество элементов, длина которых составляет 543 нм. Содержание гемоглобина высчитывается далее по формуле.

Метод сали для определения гемоглобина в крови

Анализ основывается на визуальном определении содержания гемоглобина, то есть на колориметрии. Это делают при сравнении окраски исследуемого материала с раствором солянокислого гематина.

В кровь человека добавляют хлористоводородную кислоту. Благодаря этому Hb переходит в форму солянокислого гематина. В раствор далее наливают дистиллированную воду (до тех пор, пока цвет не будет таким же коричневым, как в контрольной пробирке). Для сравнения используют специальный колориметрический аппарат.

Снизу пробирки будет цифра, которая показывает содержание показателя в 100г крови. Чтобы выделить количество клеток в литре, результат умножают на 10. Далее врач рассчитывает результаты по формуле.

Метод имеет погрешность в 30%, что делает его недостаточно точным для постановки диагноза больному. Из-за этого лаборанты применяют его в работе редко.

Читайте также

Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина

Использование спектофотометра гарантирует максимальную точность результатов исследования. Для выявления гемоглобина, необходимо перевести клетки в единую форму, так как прибор может улавливать только одну из его форм. Для этой цели берут различные реактивы.

Нужные элементы окрашивают (в красный или зеленый цвет), потом аппарат в выбранном диапазоне вылавливает длину волны клеток и подсчитывает их.

Аммиачный метод определения гемоглобина

Проведение исследования проходит по тому же принципу, что и в других методах. Главное отличие состоит в использовании аммиака в концентрации 0,04.

Сначала проба настаивается какое-то время, чтобы гемоглобин перешел в одну форму. Далее ее подсчитывает прибор — полуавтоматический анализатор спектрофометр. Раствор переливают в пробирку под лучи аппарата. Он выделяет волны длинною в 543 нанометров.

Цианметгемоглобиновый метод

Еще один анализ, который считается наиболее точным. Он основывается на свойстве железосодержащего пептидного соединения превращаться в цианметгемоглобин после добавления в биологической жидкости химическое вещество.

Реактивом выступает раствор Драбкина. Соотношение биоматериала и реагента: 2:500. Через полчаса от начала процедуры замеряют клетки длиной в 550 нм, а также уровень свободного железосодержащего пептида в плазме.

Полученные растворы сравнивают по цвету при помощи колометрии. По итогу лаборанты рисуют таблицы и узнают о количестве железосодержащего пептидного соединения в кровотоке.

Исследование мочи

Мочу возможно обследовать 4 способами. Биоматериал используют только свежий. Гемоглобин в настоявшейся урине превращается в метгемоглобин и реакция не получится.

Внимание! 

Чтобы подготовить материал к анализу, в него добавляют 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.

Для проведения исследования возможно несколько вариантов. Выбирают его в зависимости от условий проведений исследования:

• гваяковая кислота. Щепотку вещества разводят и добавляют 3 мл этанола 96%. 8-10 капель раствора наливают в такому же количеству мочи. При наличии там Hb, жидкость окрасится в синий цвет;
• амидопирин. В 2-3 мл урины добавляют 10 капель амидопирина и столько же перекиси водорода 3%. Раствор станет фиолетовым, если в нем есть гемоглобин;
• бензидит. В емкости смешивают 6 капель бензидита и перекиси водорода 3% с 4 каплями мочи. При положительном результате раствор станет зеленым;
• тест-полоски, таблетки. Подходит для домашнего самостоятельного анализа. В них уже содержится специальный раствор реактивов. Полоску опускают в небольшое количество мочи, происходит реакция. По цвету определяются результаты. Таблетки просто растворяются в биоматериале. Индикаторная шкала всегда прописана на самой упаковке, поэтому с определением показателей справится любой человек.

Определения гемоглобина в моче наиболее целесообразно для быстрого домашнего обследования. Другие методы используются и в лабораториях.

Профилактика

Повышение или понижения уровня гемоглобина означает проблемы со здоровьем и различные серьезные заболевания. Чтобы избежать этого, придерживайтесь ряда правил:

• своевременная сдача крови. Хотя бы раз в год необходимо проводить плановый анализ, который поможет следить за уровнем Hb;
• отказ от курения. Табачный дым, который вдыхает человек, связывает гемоглобин с угарным газом, что снижает способность белка доставлять кислород в клетки организма;
• полноценное питание. Проблемы с гемоглобином могут возникнуть из-за строгих диет. Продукты, богатые белком (мясо, рыба, яйца, творог, сыр) способствуют профилактике анемии. Рекомендуется увеличить потребление продуктов, богатых железом — овсянки, пшена, гречневой каши;
• при болезнях ЖКТ внимательно следите за здоровьем, так как в периоды обострения возможны кровотечения. Это снижает уровень Hb в крови.

Читайте также

От гемоглобина во многом зависит общее состояние человека. Анализ на определения его уровня — один из главных и плановых ежегодных исследований, так как белок отвечает за важную функцию — поставку кислорода в клетки организма. Hb включен в процесс дыхания и доставки углекислого газа и в легкие, с помощью которого мы живем. Поэтому необходимо следить за показателями и сверять их с цифрами нормы для вашего пола и возраста.

Определение количества гемоглобина.

Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).

Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.

Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.

Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.

Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.

Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.

Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.

Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.

Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку

Рис.  Гемоглобинометр Сали.

С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.

Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.

Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.

Вид животного	Средний показатель в % Сали	Колебания	В 100 мл крови в г	Фамилия автора
Крупный рогатый скот…. Овцы Козы Буйволы Яки Верблюды Лошади Свиньи Собаки Кошки Кролики Куры Гуси	65 68 63 49 57 90 80 67 80 65 69 75 95	56—74 54—80 45—81 28—70 36—78 66—114 50—110 55—79 65—95 47—83 51—87 51—99 80—110	11,0 11,6 10,7 8,3 9,6 15,2 13,6 10,2 13,6 11,0 11,7 12,7 16,1	Д. Соколов Л. Лебедев B. Чагин К. Мавсун-Заде П. Карасев Н. Семушкин C. Хрусталев С. Смирнов Ф. Михайлов Баранов A. Васильев B. Зайцев C. Веремейчик

Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).

Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.

Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.

Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.

Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.

Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.

У животных определение цветного показателя проводится по формуле:

Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1

Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2

Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.

Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).

Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:

75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9

Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.

Особенности определения гемоглобина в крови, основные методы диагностики и лечения патологических состояний

Общеклинический анализ крови – это первоочередное исследование, назначаемое больным при поступлении в муниципальные или частные клиники. Любые патологические изменения со стороны различных органов отражаются на составе крови.

Общеклиническое обследование крови

Общеклинический анализ исследует количественные и качественные свойства красных форменных элементов и содержание в них белка гемоглобина. Квантитативное (количественное) определение гемоглобина в крови – важная составляющая работы лабораторных сотрудников, направленная на своевременное выявление анемии.

Красные форменные клетки вырабатываются (с помощью животных белков, железа и витаминов) в красном костном мозге и разрушаются под действием ферментов селезенки. Они выполняют жизненно важные функции – транспорт кислорода к тканям и утилизацию оксидов углерода. Повышенный или пониженный гемоглобин указывает на  патологии органов различной этиологии. В предложенном ниже видео показан процесс переноса оксидов.

Строение и физиология гемоглобина

Гемоглобин – это четвертичная глобула, которая занимается утилизацией и поставкой оксидов в организме человека. Данное пептидное соединение является тетрамером, состоящим из четырех субъединиц. Одна полипептидная структура способна переносить через кровоток до четырех молекул кислорода.

Железосодержащий белок

Гемоглобин состоит из простетической группы и глобулина. Простетическую группу железосодержащего пептида принято называть «гемом». Благодаря гему кровь приобретает свойственный ей окрас – алый или синевато-красный. Простетическая группа содержит железо, которое участвует в восстановительно-окислительных процессах.

Различают несколько основных видов гемоглобина:

• Оксигемоглобин;
• Карбоксигемоглобин;
• Дезоксигемоглобин;

Оксигемоглобин образуется при присоединении кислорода к гемоглобину в условиях высокого парциального давления. При отщеплении кислорода от железосодержащего белка образуется устойчивая форма – дезоксигемоглобин. Карбоксигемоглобин появляется в результате присоединения монооксида или диоксида углерода. Стоит отметить, что монооксид углерода в 250 раз эффективнее связывается с железосодержащим белком, чем обуславливается его опасность для жизни при вдыхании (угарный газ).

Дезоксигемоглобин сильно токсичен для тканей человеческого организма, поэтому существуют специальные системы «ликвидации» гемоглобина в крови. Этим занимается особое пептидное соединение – гаптоглобин.

Определение количества гемоглобина по методу Сали

Метод базируется на свойстве железосодержащего белка превращаться в хлорид гематита под действием соляной кислоты. Методика Сали считается неинвазивным вмешательством.

Интенсивность цвета жидкости прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в крови. Раствор хлоргемина при проведении исследования разводят дистиллированной водой до стандартного цветового спектра.

Метод Салли

Важно! Стоит отметить, что гемоглобин по Сали не получил широкого распространения на территории РФ.

Метод, который применяется для определения уровня гемоглобина, принято называть «гемометром Сали». Другое название современного метода определения гемоглобина по Сали – гемоглобинометрия. Такой колориметрический аппарат состоит из специального штатива, который имеет три гнезда.

Боковые гнезда держат две склянки с веществами. Среднее гнездо данного прибора необходимо для размещения пронумерованной мензурки из стекла. Градуированная мензурка обладает шкалой с делениями, которые измеряют количество железосодержащего пептидного соединения в граммах на децилитр (г/дл). При клиническом исследовании крови используется специальная пипетка для воды и размешивания содержимого склянки.

При проведении полного анализа по методу Сали вначале в склянку наливается 0.10% раствор соляной кислоты. Потом выполняется забор исследовательского материала из кончика пальца в пипетку до отметки «0.04 мл». Впоследствии пипетку обтирают стерилизованной ваткой и размещают в мензурку с раствором HCl.

Медицинский сотрудник несколько раз встряхнет содержимое пробирки и поставит отстаиваться. Полное химическое превращение железосодержащего пептидного соединения в растворе соляной кислоты происходит не менее чем за 10-15 минут.

По истечении пяти минут оценивается цвет жидкости в гемометре со стандартными цветами. Как правило, он более темный, нежели в стандартных пробирках. Используя обычную пипетку к раствору постепенно добавляют чистую воду, попеременно перемешивая содержимое и сравнивая со стандартным цветом. На окончательном этапе цвет материала должен сравняться с нормативом. После всего вышеперечисленного замеряют уровень жидкости и проводят соответствующие подсчеты.

В промышленном масштабе выпускаются гемометры, которые содержат исключительно грамм-процентную градуированную шкалу. Нормой гемоглобина у мужчин и женщин принято считать значения 15 г%, или 168 г/дл. Но даже при соблюдении определенных правил наблюдаются небольшие погрешности в измерениях. В некоторых случаях разные результаты могут в значительной мере исказить данные о болезни.

Цианметгемоглобиновый метод определения содержания гемоглобина в крови

Стандартизированным и наиболее точным методом определения гемоглобина принято считать гемоглобинцианидный анализ. Такая методика базируется на свойстве железосодержащего пептидного соединения превращаться в цианметгемоглобин при добавлении к биологическому материалу определенного вещества.

Содержание цианметгемоглобина замеряют фотометрически. При анализе крови в роли реактива применяется раствор Драбкина. Железосодержащий белок под влиянием синеродисто-железистого калия превращается в метгемоглобин, который потом преобразуется в присутствии цианина калия в гемиглобинцианид.

Цианметгемоглобиновый метод

Типичное соотношение разведения биологического материала с реагентом — 2 : 500 (0,04 миллилитров капель крови и 10 мл реактива). По истечении 30 минут, которые нужны для полного преобразования железосодержащего пептида в гемиглобинцианид, измеряют «гашение» при длине волны в 550 нанометров и плюс толщине слоя в 2 см против воды на спектрофотометре СФ или на ФЭК и ему похожей технике. С помощью СФ также измеряют уровень свободного железосодержащего пептида в плазме.

На данный момент разработаны гемиглобинцианидные цветовые стандарты в ампулах, которые точно соответствуют определенному уровню железосодержащего белка. Растворы, полученные в результате определенных реакций, исследуют с помощью колориметрии. После всего рисуют рабочие таблицы и узнают, какое количество железосодержащего пептидного соединения содержится в кровотоке.

Есть устройства, специально созданные для определения количества гемоглобина. Зачастую используются именно циангемоглобиновые методы определения гемоглобина. Как правило, гемоглобинометрические приборы могут работать самостоятельно. Широкое применение такие тест-устройства для определения гемоглобина в крови получили в домашних условиях. Однако в ряде ситуаций больные не учитывают влияние внешних факторов в доме (стресса, еды).

Другой набор методов диагностики уровня гемоглобина в крови

Значительную известность и распространение среди различных лабораторий получила методика гемихром (или гемихромный метод). Принцип данного метода основан на преобразовании всех форм железосодержащего пептида в гемихром, который имеет красноватый цвет. Преимущество гемихромного метода заключается в том, что он не является токсичным.

Иногда назначают прохождение биохимического исследования на гликированный гемоглобин. Стоит отметить, что важное значение гликозилированный гемоглобин и глюкометр имеют при диагностике сахарного диабета.

Глюкометр

При определенных состояниях в моче может содержаться гемоглобин, поэтому нередко данная биологическая жидкость и ее анализы являются важными частями диагностики различных заболеваний. Такое случается при переливании несовместимой крови от донора, в особенности у ребенка.

Определение количества гемоглобина по методу сали: принцип определения, как делать

Стандартный анализ крови обязательно включает в себя показатель уровня гемоглобина. Такой анализ называется клиническим и является базой для исследования практически всех заболеваний. Белок гемоглобин находится в клетках крови – эритроцитах. Он выполняет важную функцию клеточного дыхания. Благодаря железу, которое в нём содержится, кровь имеет красный цвет. Колориметрический принцип определения уровня гемоглобина основан именно на таком свойстве пигментации. Как делать такой анализ предложил швейцарский врач Герман Сали (Herman Sahli) в конце 19 века.

Принцип проведения

Определение количества гемоглобина по методу Сали является классическим, его до сих пор используют во многих лабораториях. Гемоглобин – это сложный белок из группы гемопротеинов. Он состоит из двух компонентов: белкового глобина и небелкового гема. Одна молекула гемоглобина содержит 4 гема. В центре каждого из них находится атом железа, который умеет обратимо соединяться с атомами кислорода и углекислого газа, при этом не окисляясь. Именно наличие этого элемента в крови придаёт ей характерный цвет.

Читайте также

На основе такого свойства гемоглобина Г. Сали изобрёл метод измерения его количества, который основан на определении цветового показателя крови. В кислой среде глобин легко отделяется от гема, который начинает взаимодействовать с кислородом. Такая химическая реакция также меняет валентность железа и позволяет образовать новое вещество – гематин. Его и используют для колориметрического анализа количества гемоглобина в крови по методу Сали.

Что представляет собой гемометр Сали

Для подсчёта уровня гемоглобина используют прибор, который изобрёл швейцарский диагност. Гемометр Сали состоит из трёх пробирок одинакового размера. Две пробирки запаяны и наполнены раствором крови в соляной (хлороводородной) кислоте. Такая смесь носит название гематин и имеет коричневый оттенок. Интенсивность цвета зависит от количества гемоглобина. В запаянных пробирках гемометра цвет соответствует стандарту содержания гемоглобина в крови здорового человека.

На заметку!

Норма гемоглобина в крови мужчин составляет 130-160 г/л, у женщин – 120-140 г/л.

Третья пробирка имеет шкалу, на которой отмечены грамм-проценты и единицы гемометра. Эта ёмкость заполняется анализируемым материалом. Колориметрический анализ производится лаборантом визуально. Анализируемый гематин разбавляют водой до определённого цвета, который сравнивают со стандартным образцом.

Методика проведения

Для проведения лабораторного исследования крови по методу Сали осуществляют следующие действия. Пустую пробирку гемометра заполняют соляной кислотой до нижней отметки. Концентрация раствора должна составлять 0,1 Н. Далее специальным капилляром, который входит в комплект гемометра, набирают 0,02 мл крови пациента.

Капилляр опускают в кислотный раствор и аккуратно выпускают в него, забранный у пациента, материал. Кровь должна оказаться под слоем кислоты так, чтобы сама кислота осталась прозрачной. Далее содержимое пробирки перемешивают и выдерживают в нетронутом состоянии 5-15 минут. За это время произойдёт взаимодействие жидкостей, и образуется гематин коричневого цвета.

В образовавшееся вещество по капле добавляют дистиллированную воду, пока цвет не станет идентичным с цветом образца в запаянной пробирке гемометра. Каждый раз гематин размешивают стеклянной палочкой. При этом жидкость поднимается, её уровень соответствует шкале контрольной пробирки. Как только цвет анализируемого материала сравняется со стандартным цветом, лаборант отмечает, какому делению шкалы грамм-процентов соответствует поднявшаяся жидкость. Для перевода в необходимые граммы на литр полученную цифру умножают на 10.

Насколько точный метод определения гемоглобина

Швейцарский диагност изобрёл свой способ определения гемоглобина в крови в конце 19 века. На тот момент этот способ был самым точным. Но новые исследования, открытия в области медицины и молекулярной диагностики создали новые методы. Появились аппаратные методики, которые исключают человеческий фактор при исследованиях. Они способны оценивать биологический материал при помощи более точных замеров.

Читайте также

В связи с этим у метода Сали есть ряд недостатков, которые снижают точность измерения:

1. Анализ цветного показателя гематина лаборант проводит визуально. Поэтому на точность влияет освещение в помещении, способность конкретного человека различать нюансы цветового спектра, особенности зрения лаборанта. Но даже здоровый человеческий глаз не может улавливать минимальные отклонения цвета, в отличие от высокоточной аппаратуры.
2. Образцы в гемометре Сали со временем выцветают. Изменённый цвет стандарта даёт большую погрешность конечного результата.
3. Превращение крови в гематин имеет разное время реакции. Определить конечный этап реакции невозможно, он колеблется от 2 до 40 минут и зависит от содержания в крови белков. Также оттенок может меняться и из-за разного количества билирубина.

Из-за указанных недостатков колориметрическое измерение по методу Сали имеет погрешность до 30%. В феврале 2000 года был издан Приказ № 45 Министерства Здравоохранения РФ, в соответствии с которым смещение коэффициента показателя гемоглобина в крови не должно превышать 5%. В связи с этим использование метода Сали на сегодняшний день не является пригодным для использования в клинико-диагностических лабораториях.

Совет!

Если есть сомнения в методах диагностики, необходимо уточнять их в лаборатории перед сдачей крови.

Отзывы

Мария

Сдавала анализ крови после гриппа. Делала в своей поликлинике по прописке. Результат поверг меня в настоящий шок – гемоглобин был сильно завышен относительно нормы. Решила пересдать кровь, только уже в платной лаборатории. Показатели оказались в норме. Администратор лаборатории объяснила, что метод Сали, который часто используют поликлиники, имеет погрешность.

Андрей

А мне в поликлинике сразу сказали, что используют недорогой метод Сали. Типа у него есть погрешности, но в пределах нормы, но можете и в другом месте сдать, если сомневаетесь. Почитал, этот метод вообще-то давно используется, и никогда проблем у людей не было. Не собираюсь переплачивать за анализы в платных лабораториях.

Светлана

Учусь на медика метод Сали, мы не раз тестировали в лабораториях. И доверия к нему мало, погрешность есть. Если нужен тест на какое-то серьёзное заболевание, лучше проводить более высокоточное и современное обследование. Можно тоже колориметрическое обследование, но только гемиглобинцианидное. Но вообще странно, сейчас метод Сали уже почти не используют, найти поликлинику с такой лабораторией сложно.

Несмотря на неточность результатов исследования и устаревшие способы их проведения, в некоторых лабораториях продолжают использовать метод Сали для определения содержания гемоглобина в крови. Такой способ является самым недорогим, быстрым и технически простым, но без сомнений влияет на точность результатов анализа.

Определение гемоглобина в крови: методы диагностики

Анализ крови –  один из самых необходимых. Определение концентрации гемоглобина в крови пациента позволяет выявить многие заболевания или пограничные состояния. Благодаря распространенным способам анализа исключают или выявляют анемии и следят за уровнем эритроцитов. Современные методики с точностью позволяют изучить состав кровяных телец и подсчитать их количество.

Клиническое значение определения гемоглобина

У мужчин показатель содержания гемоглобина в крови варьирует в пределах 120-160 г на литр, а у женщин – 110-150 г/л. Это объясняется тем, что мужчины более плотные по строению и имеют высокую мышечную массу. Иногда наблюдается снижение концентрации этого показателя в связи физиологическими и патологическими состояниями:

• беременность и послеродовой период;
• болезни костного мозга;
• недостаток витамина В12 и фолиевой кислоты;
• снижение количества эритроцитов из-за нехватки железа;
• кровопотери.

Наряду с анемией встречается и завышение показателя:

• избыток эритроцитов или эритроцитоз. Встречается при злокачественных новообразованиях и болезнях костного мозга;
• эритроцитоз вследствие заболеваний сердца и сосудов;
• снижение количества плазмы крови, что делает ее вязкой и увеличивает количество кровяных телец в литре биологической жидкости.

Гемоглобин образуется в красных кровяных клетках после утраты ядра и созревания клетки, период жизни которой длится не более 120 дней. После утилизации клетки в селезенке, в кровь выделяется железо, которое доставляется в костный мозг. Далее этого образуются новые эритроциты.

Методы измерения гемоглобина в крови

Для измерения показателя в крови используют несколько колориметрических способов:

1. Гемиглобинцианидный.
2. Гемихромный.
3. Метод Сали.
4. Аммиачный.

После любого из методов используют полуавтоматический анализатор, измеряющий спектр длины волны молекулы гемоглобина.

Автоматические методы не смогут распознать нарушения состава крови, но исключат ошибки в подсчёте параметров. Ручной метод используется с применением реактивов и биологической жидкости и способен определить лишь наличие или отсутствие клеток.

Гемиглобинцианидный метод

Гемоглобин имеет много форм, что затрудняет измерение его длины волны. Чтобы сделать процедуру проще, этот показатель переводят в метгемоглобин. Для точности результата используют специальное оборудование: мерные пробирки, фотоэлектроколориметр, трансформирующий раствор. Нормальный показатель длины волны – 540 нм, в этом диапазоне и работает прибор. Расчёты производят по формуле, а итоговый показатель переводят в граммы на литр (г/л).

Интересный факт!

Этот метод применяется для определения уровня гемоглобина все реже, в связи с опасностью для лаборантов, так как реактив может вызвать ожоги кожи и слизистых.

Гемихромный метод

С помощью безопасных специальных реактивов гемоглобин переводят в циангемоглобин. Для этого используют SDS, соли жирных кислот, четвертичный аммоний. В результате образуется гемихром, который также измеряется методом колориметрии в фотометре, при длине волны 540 нм. В конце также используют формулу для расчёта и переводят единицы измерения в г/л.

Плюсом такого метода можно назвать быстроту реакции и получение результата за считанные минуты. Лаборатории часто применяют этот метод с использованием реактивов Ольвекс. Они полностью безопасны, долговечны и экономичны.

Метод Сали

Более устаревший способ анализа, который используют редко. Принцип заключается в добавлении в биоматериал  хлористоводородной кислоты, что помогает перевести гемоглобин в солянокислый гематин. Далее добавляют дистиллированную воду до коричневой окраски и сравнивают цвета с контрольной пробиркой. Отметка на пробирке указывает на количество вещества в 100 г крови. Для получения результата в литре показатели умножают на десять и вычисляют показатель с помощью пропорции.

Аммиачный метод

Этот метод основан на предыдущих, только в качестве раствора используют аммиак 0,04%. Пробу настаивают для перехода всех форм гемоглобина в одну. Далее рассчитывают результат с помощью фотометра при длине волны 543 нм. Наиболее точным считается гемихромный метод. Таким образом можно исключить риск ошибки, так как все расчеты ведут, основываясь на показателях прибора. Кроме того, этот способ наиболее безопасный и не несет вреда для лаборантов.

Гемоглобин — это важный показатель для врача и пациента. С помощью такого анализа можно судить о наличии заболевания, кровотечения и состояния сердечно-сосудистой системы. Важно проводить анализ с целью профилактики, чтобы не допустить анемию или патологическое превышение показателя. Полученные данные лаборатории должны быть интерпретированы врачом. Только так можно избежать осложнений заболеваний и получить правильное лечение.

2) Определение количества гемоглобина в крови по способу Сали (Учебное пособие «Физиология крови», стр.23)

Ход работы: с помощью пипетки налить в среднюю пробирку гемометра Сали 0,1 % раствор хлористоводородной кислоты до нижней метки. Протереть спиртом и проколоть кожу мякоти пальца. С помощью микропипетки и резиновой груши набрать 20 мкл крови. Обтереть кончик капилляра и, погрузив его в 0,1% раствор хлористоводородной кислоты на дно пробирки гемометра, осторожно, чтобы не образовалась пена, выдуть кровь и дважды сполоснуть капилляр раствором. Оставить гемометр на 4-5 минут. За это время кислота, разрушив оболочку эритроцитов, превратит гемоглобин в хлорид гематина, который имеет характерный коричневый цвет. В среднюю пробирку прибавлять по каплям дистиллированную воду до тех пор, пока цвет раствора в ней не станет таким, как в стандартных пробирках. Это и будет величина, которая арактеризует количество гемоглобина в крови в абсолютных или тносительных единицах (в зависимости от типа шкалы гемометра).

3) Расчет цветового показателя крови (Учебное пособие «Физиология крови», стр.24)

Величина этого показателя воссоздает относительное содержание гемоглобина в эритроцитах. При нормальном насыщении эритроцитов гемоглобином цветовой показатель находится в границах 0,86-1,05. Увеличение или уменьшение его свидетельствует о нарушении насыщения эритроцитов гемоглобином. Для расчета цветового показателя крови пользуются формулой:

ЦП = (количество Нв (г/л) * 3)/первые три цифры числа эритроцитов (в 1 мкл)

4) Лейкоцитарная формула (Учебное пособие «Физиология крови», стр.59-60)

5) Определение времени продолжительности кровотечения и скорости свертывания (Учебное пособие «Физиология крови», стр.49)

Время

Ход работы. Стерильным скарификатором делается прокол пальца и сразу же начинают отсчет времени. Выступающую каплю крови каждые 30 сек осторожно впитывают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к раневой поверхности. Момент, когда на фильтровальной бумаге больше не появляется кровяное пятно, отмечают как окончание кровотечения.

В норме при определении времени кровотечения этим способом кровотечение останавливается через 2-3 мин.

Определение скорости свертывания крови по Сухареву.

Ход работы: Кровь для анализа берут из пальца руки человека. Набирают в капилляр столбик крови высотой 25 — 30 мм. Отмечают по секундомеру время. Наклоном капилляра переводят кровь на середину трубки. Держа капилляр двумя пальцами, покачивают его на 30 — 45^ в обе стороны. Свободное смещение крови показывает, что свертывание еще не наступило.

Начало свертывания характеризуется замедлением движением крови при наклоне капилляра: на его внутренней стенке появляются небольшие сгустки.

Полное свертывание крови соответствует моменту полной остановки движения крови. В выводах осветить какие процессы гемостаза отражают данный метод.

6) Определение группы крови (Учебное пособие «Физиология крови», стр.57)

Ход работы: на специальные тарелки наносят (не смешивая!) по капле стандартной сыворотки 1, 2 и 3 групп, содержащей соответственно

агглютинины 1 — альфа и бета; 2 — бета и 3 — альфа. Углом предметного стекла переносят небольшое количество крови, полученной из пальца, в каплю сыворотки 1 группы, затем вторым чистым углом предметного стекла такое же количество крови переносят в сыворотку 2 группы. Третью каплю переносят в сыворотку 3 группы третьим углом предметного стекла. Каждый раз тщательно размешивают кровь в капле сыворотки, пока смесь не станет равномерно розового цвета. Реакция агглютинации наступает через 1 — 5 мин. При наличии агглютинации капля становится прозрачной, а эритроциты склеиваются в виде комочков. Группа крови устанавливается в зависимости от наличия или отсутствия агглютинации. Зарисуйте схематично результаты опыта, а в выводах определите, каким реципиентам может быть перелита исследуемая кровь и какие современные требования к гемотрансфузии крови в зависимости от Фуппы крови донора и реципиента.

Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

ПЕРВОЕ ВЫСШЕЕ ТЕХНИЧЕСКОЕ УЧЕБНОЕ ЗАВЕДЕНИЕ РОССИИ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра металлургии

Курсовая работа по дисциплине:

Методы контроля и анализа веществ

ТЕМА: Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

Выполнил: студент гр. МЦ – 14 /Бурый Ф.И.

Проверил: доцент кафедры металлургии /Цыбизов А.В.

Санкт-Петербург

2017

Введение

С момента открытия и описания красных кровяных телец (эритроцитов) Яном Сваммердамом в 1658 г. и независимо Антони Ван Левенгуком в 1674 г. люди долгое время не имели возможности узнать, насколько важную функцию выполняют эти мельчайшие клетки крови. В эритроцитах находится белок (гемоглобин), способный переносить кислород по крови к остальным тканям и забирать углекислый газ из них и переносить его к легким. Данная особенность гемоглобина была впервые обнаружена Г. Хюнефельдом в 1840 г., пару лет спустя немецкий биохимик Феликс Гоппе-Зейлер подтвердил данную, реверсивную возможность белка переносить и кислород, и углекислый газ, а также дал современное название гемоглобину. О роли гемоглобина в переносе кислорода по тканям организма также заявлял французский физиолог Клод Бертран в 70-е годы XIX века. Однако всеобъемлющих исследований этого белка не проводилось вплоть до середины XX в. Строение гемоглобина, как и строение многих белков, оставалось слишком сложным для того, чтобы определить его до эры такого аналитического метода химии и биохимии, как рентгеноструктурный анализ.

Большой вклад в исследование структуры и функционирование гемоглобина внёс Макс Перуц, один из отцов-основателей молекулярной биологии, получивший за это в 1962 году Нобелевскую премию. Благодаря его трудам, теперь мы знаем, что гемоглобин взрослого человека (HbA) является тетрамером, состоящим из двух α- и двух β-субьединиц (отдельных белковых цепей, объединяющихся в составной функциональный белок). α- И β-цепи гемоглобина немного отличаются аминокислотной последовательностью, но имеют сходную форму, из-за чего сам тетрамер гемоглобина представляет собой почти правильный тетраэдр.

Гемоглобин — основной дыхательный пигмент и главный компонент эритроцита Он также играет существенную роль в поддержании кислотно-основного равновесия крови. Буферная система, создаваемая гемоглобином, способствует сохранению рН крови в определенных пределах. Подсчитано, что в одном эритроците содержится около ~ 340000000 молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 103 атомов. В крови человека в среднем содержится ~ 14,5% гемоглобина, его общее количество ~ 750 г.

С развитием медицинской биохимии было предложено множество методов определения концентрации гемоглобина. Важнейшие группы этих методов следующие:

1. Колориметрические методы. Чаще колориметрируют цветные производные гемоглобина: солянокислый гематин, карбоксигемоглобин, цианометгемоглобин, гемиохром. Колориметрические методы широко применяются на практике ввиду их простоты и доступности. Наиболее точными и надежными из них являются цианометгемоглобиновый и гемиохромный методы.

2. Газометрические методы. Гемоглобин насыщают газом, напримеркислородом или окисью углерода. По количеству поглощенного газа судят о количестве гемоглобина.

3. Методы, основанные на определении железа в гемоглобиновой молекуле. Так как гемоглобин содержит строго определенное количество железа (0,374%), то по его содержанию устанавливают и количество гемоглобина.

Две последние группы точны, но требуют много времени, технически более сложны и поэтому не нашли широкого применения в практике.

Задачей данной работы является сравнение двух наиболее часто применяющихся в медицинской практике методов количественного анализа гемоглобина: гемоглобинцианидного и гемиохромного. Нахождение концентрации гемоглобина в крови автора курсовой работы. Поиск коэффициента корреляции по построенным калибровочным графикам между двумя методами.

Методы анализа

Общая характеристика методов

Определение содержания гемоглобина в крови человека является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

Из «старых» методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали.

При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20-30%.

В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает ~ 30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; характера освещения и пр.

Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются.

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа. Однако, некоторые особенности не позволяют использовать гемиглобиназидный метод в качестве альтернативного в силу следующих причин:

1) Конечный продукт превращения гемоглобина – HbN3 имеет слабый пик поглощения при λ = 540 нм, что не дает возможности использовать фотометры с широкополосными фильтрами;

2) Возникают проблемы, связанные с мутностью растворов;

3) Раствор HbN3 не хранится при комнатной температуре.

Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы лишены этих недостатков и при дальнейших исследованиях им было отдано предпочтение.

Интерференция при всех колориметрических методах анализа:

1) Повышение гемоглобина: гипертриглицеридемия, количество лейкоцитов более 25х109/л, прогрессирующие заболевания печени, наличие легко преципитирующихся глобулинов (при миеломной болезни или при макроглобулинемии Вальденстрема).

2) Понижение гемоглобина: у заядлых курильщиков вследствие образования неактивного HbСО.¹

Гемоглобинцианидный метод

Принцип гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну — гемиглобинцианид (то же что и цианометгемоглобин). Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:

1) HbCN является стабильной производной гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;

2) Спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при λ= 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

3) Растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при λ= 540 нм в широком диапазоне концентраций;

4) Калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.

Реагенты, необходимые для количественного определения гемоглобина:

Трансформирующий реагент:

Назначение трансформирующих реагентов переводить все формы гемоглобина в гемиглобинцианид. Оптимальный состав и чистота исходных компонентов для трансформирующего раствора, предложенные Van Kampen и Zijlstra, позволяют количественно трансформировать все формы гемоглобина в гемиглобинцианид, получать результаты через 3-5 мин, которые практически не зависят от присутствия белков плазмы крови.

Состав трансформирующего раствора: К3Fe(CN)6, 200 мг; КСN, 50 мг; Kh3PO4; 140 мг; неионные детергенты типа Nonic 218, Nonidet P-40, Triton X-100 по 1 мл/л. Все компоненты растворяют и разбавляют до 1 л дистиллированной водой; рН приготовленного раствора должен быть в пределах 7,0-7,4.

Модификации трансформирующего реагента:

Для гемиглобинцианидного метода оптимальный состав трансформирующего реагента указан выше. В некоторых коммерческих наборах реагентов, предназначенных для определения гемоглобина, состав и концентрация исходных компонентов трансформирующего реагента отличаются от оригинала. Так, КСN часто заменяют ацетонциангидрином, Kh3PO4 – NаНСО3; во многих наборах детергенты исключены совсем.

Однако, замена рекомендуемых компонентов в определенной концентрации приводит к увеличению времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности (20 мин против 5) и меньшему сроку сохранности трансформирующего раствора.

Для устранения влияния некоторых компонентов, присутствующих в крови, в состав трансформирующих реагентов вводят соответствующие добавки. Введение липазы устраняет влияние липидов; увеличение концентрации Kh3PO4 ̶ солей аммония; введение метанола, этанола, этиленгликоля устраняет распад компонентов реагента при его замерзании. Эти добавки не влияют на правильность результатов анализа.

Калибровочный раствор гемиглобинцианида:

При определении гемоглобина трансформирующий реагент только переводит все его формы в стойкое соединение гемиглобинцианид (метгемоглобин), но не определяет точность процедуры измерения гемоглобина. Для гарантии точности метода применяют калибровочные растворы с точно установленной концентрацией гемоглобина. Международный (стандартный) калибровочный раствор гемиглобинцианида готовится от имени ICSH и служит для аттестации коммерческих калибровочных растворов. Допустимая ошибка определения гемоглобина при использовании Международного калибровочного раствора — менее ± 2%.

Калибровочные растворы гемиглобинцианида получают, как правило, путем введения высокоочищенного раствора гемоглобина в трансформирующий раствор. Международный комитет по стандартизации в гематологии начал работу по стандартизации калибровочного раствора гемиглобинцианида в 60-х гг. Первый образец гемиглобинцианида был предложен ВОЗ в 1967 г., но в последующие годы (1980, 1981, 1983) еще проводились уточнения его характеристик, и только в 1985 г. был установлен международный стандарт гемиглобинцианида, отвечающий всем требованиям, сформулированным Международным Комитетом по стандартизации в гематологии.

Контрольные растворы гемоглобина:

Использование калибровочных растворов позволяет точно определить концентрацию гемоглобина в крови, если при анализе не было допущено различных погрешностей. Погрешности можно выявить с помощью контрольных растворов гемоглобина. Контрольные растворы гемоглобина — это высокоочищенные имитаторы крови человека, не содержащие примесей, искажающих результаты анализа. Концентрация гемоглобина в контрольных растворах определена с точностью ~ 2%. Аттестация этих растворов проводится на фотометрах высокого класса точности при использовании дозаторов с погрешностью дозирования менее 1%.

Наличие панели наборов реагентов для определения гемоглобина в крови: трансформирующего реагента, калибровочных растворов гемиглобинцианида и контрольных растворов гемоглобина обеспечивает возможность получения результатов с погрешностью, не превышающей ± 2%. гемоглобинцианидный медицинский калибровочный корреляция

Требования безопасности при работе с раствором, содержащим цианистые соединения:

При всех положительных параметрах гемиглобинцианидного метода большим его недостатком является то, что он основан на применении ядовитых цианистых соединений. Вместо цианистого калия многие применяют маскированный цианид ̶ ацетонциангидрин. Характер действия ацетонциангидрина на человека сходен с действием синильной кислоты, но эффект развивается медленнее.

Ацетонциангидрин всасывается через кожу и может вызывать тяжелые отравления. Его предельно-допустимая концентрация (ПДК) составляет 0,9 мг/м3, класс опасности 2.

Для работы с цианистыми соединениями необходимо соблюдение специальных мер предосторожности: применение фильтрующих противогазов, спецодежды; оснащение рабочего места местной и общей вытяжной вентиляцией; необходимостью проведения контроля за концентрацией ацетонциангидрина в воздухе, тщательную герметизацию аппаратуры и ее продувание перед началом работы.

Реакцию ацетонциангидрина с гемом метгемоглобина можно представить в следующем виде (где пунктирными линиями обозначены координационные связи железа):

Гемиохромный метод

С развитием методов анализа для определения гемоглобина в крови разработан новый колориметрический метод, не содержащий в составе реагентов цианистых соединений, которые заменены жирными кислотами с ферроцианидом калия или поверхностно-активными веществами, лучший из которых — додецилсульфат натрия (SDS, он же SLS — лаурилсульфат натрия).

Принцип гемихромного метода:

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну: гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфатом натрия, происходит его превращение в комплексное соединение — гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе. Образование комплекса происходит согласно реакции:

SLS + HGb = [SLS+HGb]

Характеристика метода:

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови разработан Ахрем А.А. с соавторами в 1986 г. Набор реагентов для определения гемоглобина в крови, основанный на данном методе, одобрен Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ и рекомендован к применению в клинико-диагностических лабораториях уже в 1998 г. Основные достоинства гемихромного метода:

1) Гемихром — стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbChr;

2) Спектр поглощения HbChr имеет плоский максимум вблизи λ= 540 нм , поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

3) Растворы HbChr строго подчинены закону Ламберта-Бера при λ = 540 нм в широком диапазоне концентраций;

4) Калибровочный раствор HbChr устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет;

5) Трансформирующий реагент не ядовит и безвреден: в его составе не содержится цианистых соединений.

Сравнение гемихромного и гемиглобинцианидного методов:

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г/л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99.

Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Реагенты, необходимые для определения гемоглобина:

Трансформирующие реагенты

Для перевода гемоглобина в HbChr имеется несколько трансформирующих реагентов, отличающихся по составу:

— четвертичные аммониевые соли с ПАВ (тритон Х-100, бридж — 35)

— соли жирных кислот (С14- С20) с феррицианидом калия и ЭДТА в трисовом буфере;

— SDS (или SLS, лаурилсульфат натрия, ПАВ).

Из перечисленных трансформирующих реагентов лучшим является SDS. Максимальная скорость превращения гемоглобина в HbChr отмечена именно при его взаимодействии с SDS, полное превращение которого происходит за 5 мин. Спектр поглощения HbChr в области 540 нм имеет большое сходство со спектром поглощения гемиглобинцианида.

Калибровочный раствор гемихрома:

В 1998 г. Пупковой В.И. с соавторами разработан, запатентован и внедрен в практику Набор реагентов для определения гемоглобина гемихромным методом, содержащий калибровочный раствор гемихрома. Набор зарегистрирован в МЗ РФ и рекомендован к применению. Калибровочный раствор гемихрома обладает достаточной стабильностью (не менее 1 года) и обеспечивает высокую точность измерения гемоглобина при λ = 540 нм.

Созданный калибровочный раствор гемихрома соответствует всем требованиям, предъявляемым к калибровочным растворам: это стерильный водный раствор, разлитый в ампулы из светозащитного стекла, прозрачен.

Аттестация калибровочных растворов гемихрома проводится опосредованно относительно Государственного калибровочного раствора гемиглобинцианида с погрешностью, не превышающей ± 2%, поэтому и результаты одной пробы, полученные обоими методами, сопоставимы: их расхождение также не превышает ± 2%. При теоретическом молярном коэффициенте экстинкции гемиглобинцианида, равном 11,00, молярный коэффициент экстинкции гемихрома составляет ~ 10,14. Эту величину предстоит еще уточнить.

Контрольные растворы гемоглобина:

Для гемихромного метода используются те же самые контрольные растворы гемоглобина, что и для гемиглобинцианидного метода.

Описание наборов реактивов и оборудования, примененных в исследовании

Набор реактивов:

Гемоглобин-13-Ольвекс

Набор «ГЕМОГЛОБИН-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови унифицированным гемиглобинцианидным методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 400 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием феррицианида калия гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) с железом в форме Fe3+, который в присутствии ацетонциангидрина трансформируется в окрашенный комплекс цианометгемиглобин (гемиглобинцианид), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520-560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,35, CМ = 10∙10-3 моль/л

Ферроцианид калия, CМ = 6,1∙10-3 моль/л

Brij 35 (Синтанол, с общей формулой C20h55O5), Сг/л = 5 г/л

Ацетонциангидрин, СМ = 11,2∙10-3 моль/л

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 200 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Окраска стабильна в течение 6-ти часов в защищенном от света месте. Качество набора может проверяться на отечественных или зарубежных контрольных образцах крови, с аттестованным по данному методу показателем.

Нормальные величины содержания гемоглобина в крови:

Мужчины – 132-164 г/л;

Женщины – 115-145 г/л.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Меры предосторожности:

Потенциальный риск применения набора ̶ класс 2а. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными. В состав монореагента входит ядовитый ацетонциангидрид. При работе с набором следует избегать попадания этого реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.

Гемоглобин-15-Ольвекс

Набор «ГЕМОГЛОБИН-15-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемихромным колориметрическим методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 800 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием реагента, содержащего SlS (натрия лаурилсульфат), гемоглобин трансформируется с образованием окрашенного соединения – гемихром. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520-560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,4, CМ = 1 моль/л

Натрия лаурилсульфат (SLS), Cг/л = 129 г/л

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 220 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.

Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Методы предосторожности:

Потенциальный риск применения набора – класс 1. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными при работе с набором следует не допускать попадания реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженной место большим количеством проточной воды; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. При плохом самочувствии следует обратиться к врачу. При работе с набором следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.

Оборудование

Микропипетка типа Сали объемом 20 мкл.

Предназначена для дозирования 20 мкл жидкости. Маркировка на пипетке нанесена коричневой краской, устойчивой к механическим и химическим воздействиям. Пипетка изготовлена из химико-лабораторного стекла по ГОСТ 21400-75.

Объем, 20±0,5 мкл;

Внешний диаметр: 5,0±1,0 мм;

Длина: 150±2,0 мм

Спектрофотометр

Спектрофотометр ПромЭкоЛаб ПЭ – 5300В

Спектрофотометр ПромЭкоЛаб модель ПЭ-5300 В выпускается на протяжении многих лет и используется для выполнения всех фотометрических методик количественного анализа в соответствии с лабораторными требованиями любых отраслей народного хозяйства РФ.

Спектрофотометр используется для контроля состава воды, почвы, воздуха в экологических и санитарно-гигиенических исследованиях, а также при анализе сырья, готовой продукции, металлов и сплавов, хим. продукции и т.д.

Спектральный диапазон длин волн, нм	325 — 1000
Спектральная ширина щели, нм	4
Погрешность установки длины волны, нм, не более	± 2
Воспроизводимость установки длины волны, нм	1
Фотометрическая точность	±1 % T
Фотометрический диапазон: — оптическая плотность, А — коэффициент пропускания, Т	0.0 — 1.999 0 — 125 %
Фотометрический режим	T, A, C
Рабочая длина кювет, мм	5 — 100
Источник света	галогенная лампа
Цифровой выход	RS-232C
Требования по питанию	220 В / 50 Гц или 110 В / 60 Гц
Размеры (Ш×Г×В), мм	480×360×160
Вес, кг	8,0

Скарификаторы Medlance Plus, 2 мм

Автоматические скарификаторы используются для забора крови из безымянного пальца. После дезинфекции пальца, к подушечке прикладывается скарификатор, пружина вводит иглу на 2 мм для обеспечения сильного капиллярного кровотока, первая капля крови снимается ватой, т.к. может содержать межклеточную жидкость, остальная кровь идет на забор образца и, как можно скорее, вводится в трансформирующий раствор.

Дополнительное оборудование: мерные колбы, цилиндр объемом 1 л, пробирки объемом 10 мл, пипетки объемом 1 и 5 мл, кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

Ход работы

Для гемиохромного метода:

Проведем расчеты для построения калибровочного графика эталонного раствора гемоглобина с Cг/л = 120 г/л .

Для этого флакон с концентрированным монореагентом нагреем до комнатной температуры (+18-25оС) перенесем в мерную колбу или цилиндр объемом 1000 мл, объем доведем до метки свежеприготовленной дистиллированной водой. Аккуратно перемешаем, избегая пенообразования. Подготовим пробы в соответствии с таблицей: